气管内肺内喷雾（TIPS）技术作为急性吸入毒性评估替代方法的可行性研究

本文推荐了一种创新的急性吸入毒性评估方法——气管内肺内喷雾（TIPS）技术。该研究通过将12种挥发性化学品经TIPS技术染毒大鼠，并将获得的LD50值转换为LC50值，与已报道的吸入LC50值进行比较。结果显示，在11种水溶性化学品中，有9种化学品的TIPS LC50值与吸入LC50值高度吻合。研究表明，TIPS技术无需复杂昂贵的吸入暴露设备，有望成为普通动物设施进行急性吸入毒性评估的可行替代方案，为解决大量化学品尚未进行吸入毒性评估的难题提供了新思路。

　　

1 引言

根据全球化学品统一分类和标签制度（GHS），对于存在吸入暴露危害的物质，应进行急性吸入毒性评估以确定其安全分类。目前，体内研究通常采用整体暴露或仅鼻部吸入腔，并遵循OECD测试指南436（TG 436）进行。然而，由于未评估化学品的数量庞大、实验成本高昂、质量控制困难以及具备进行体内吸入暴露研究设施的机构匮乏，亟需开发更经济、简便的方法来确保化学品的安全使用。整体暴露所需的大型/昂贵设施众所周知，但即使是仅鼻部吸入研究也需要专用设备。

研究人员一直在使用气管内肺内喷雾（TIPS）方法评估几种碳纳米管和颗粒的吸入毒性。该方法不需要特定的设备或大型设施，因此适用于一般的动物设施。本研究旨在探讨使用TIPS技术测试空气传播化学品的急性吸入毒性的可能性。同时，还评估了测试化学品对A549细胞的体外细胞毒性，以初步分析是否为体内研究的剂量设置提供有用数据。

2 材料与方法

2.1 动物

实验使用12周龄雄性F344大鼠，购自查尔斯河日本公司。动物饲养于名古屋市立大学医学院实验动物科学中心，维持12小时光暗周期，自由摄食东方MF基础饲料和自来水。实验方案经名古屋市立大学医学院动物护理与使用委员会批准（批准号24-005），研究根据名古屋市立大学实验室动物护理与使用指南进行。经过2周的适应和检疫期后开始实验。

2.2 化学品

测试了12种化学品：1,4-二噁烷、2-乙氧基乙基乙酸酯、乙酰丙酮、1,2-二氯乙烷、甲基丙烯酸缩水甘油酯、二甲苯、缩水甘油、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、丙烯醛、聚丙烯酸5000和叔丁醇。所有测试化学品均购自FUJIFILM Wako Chemicals。这些化学品及其根据GHS的急性毒性分类列于表中。GHS急性毒性分类的描述可参考GHS（第3.1章）。

2.3 体外试验

体外细胞毒性试验使用中性红，根据Repetto等人的方法进行。A549人肺腺癌细胞系源自人肺癌，购自美国典型培养物保藏中心（ATCC），以饱和密度90万/皿接种于35毫米培养皿（生长面积9.2 cm2）中，使用RPMI培养基+10%胎牛血清（FBS）。次日，将测试化学品在4 mL RPMI和4 mL RPMI + 10% FBS中稀释，浓度梯度为0, 0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 3.2, 6.4, 12.8, 25.6, 和51.2 μL/mL。移去组织培养皿中的培养基，加入2 mL含有各稀释浓度测试化学品的培养基：每个浓度在RPMI和RPMI + 10% FBS中各设两个培养皿。剩余两个培养皿中的细胞暴露于致死剂量的2-乙氧基乙基乙酸酯。细胞在测试化学品中孵育15分钟，然后吸弃含化学品的培养基，用PBS清洗细胞两次。每皿加入2 mL中性红溶液，孵育3小时，然后再次用PBS清洗两次，用酸-乙醇溶液溶解细胞，读取540 nm处的吸光度。以0 μL化学品培养皿的读数为100%存活率，以250 μL/mL 2-乙氧基乙基乙酸酯培养皿的读数为0%存活率。确定LD₅₀后，围绕初始实验确定的LD₅₀进行最终系列稀释，以三重复培养皿暴露，确定体外LD₅₀值。这些LD₅₀值用于计算300克大鼠的剂量。

2.4 剂量计算

TIPS剂量基于体外分析的LD₅₀计算。体外LD₅₀值显示于表中。将较低的LD₅₀除以二，用于近似估计300克大鼠在四次给药后存活率为0%的剂量。将较高的LD₅₀乘以四，用于近似估计300克大鼠在四次给药后死亡率为100%的剂量。将这些剂量转换为300克大鼠灌服600 μL溶液（2 μL/g体重）的mg/kg剂量。一旦确定了mg/kg剂量，该剂量即可应用于所有大鼠。单次TIPS剂量显示于表中。

2.5 TIPS

将大鼠分为每组6-8只，用于每个化学剂量。按照先前描述的方法，通过TIPS向大鼠施用600 μL含有测试化学品的TIPS溶液。简言之，对于每组大鼠，将测试化学品悬浮于生理盐水中，使得每克体重施用2 μL稀释化学品即可达到目标剂量。用3%异氟烷麻醉大鼠并称重。将每克体重2.0 μL测试溶液吸入一次性1 mL注射器。将注射器连接到气溶胶喷雾器，将喷雾器喷嘴插入气管至隆突水平，将溶液喷入大鼠肺部。为模拟4小时吸入暴露，在3小时内（0, 1, 2, 和3小时）通过TIPS进行四次给药。随后观察大鼠14天。

使用GraphPad Prism 8版进行非线性回归分析，计算体内TIPS LD₅₀值。

2.6 体内吸入LC₅₀值与转换的体内TIPS LC₅₀值比较

表中列出了吸入LC₅₀值及其来源。当数值以ppm报告时，使用24.45 L作为理想气体的摩尔体积将ppm转换为mg/L。然后将这些值转换为4小时暴露期的LC₅₀值。假设LC₅₀值与暴露时间成正比。

使用12周龄雄性Fisher 344大鼠的分钟通气量为54 mL/min，将TIPS LD₅₀值转换为相应的LC₅₀值。因此，一只12周龄大鼠（平均体重300克）在4小时内吸入的空气体积为0.054 L/min × 240 min = 12.96 L。表中显示了吸入LC₅₀值与转换后的TIPS LC₅₀值。

3 结果

3.1 体外中性红毒性试验

A549细胞在RPMI和RPMI + 10% FBS中暴露于测试化学品。12种测试化学品的体外LD₅₀值显示于表中。FBS的存在对LD₅₀影响很小或没有影响。体外LD₅₀用于确定一个可能包含体内TIPS给药实验LD₅₀的剂量范围。预计导致大鼠存活率为100%的化学品量为体外较低LD₅₀的一半，预计导致大鼠存活率为0%的化学品量为体外较高LD₅₀的四倍。将这些值转换为300克大鼠的单次TIPS给药剂量。这些单次TIPS剂量显示于表中。

3.2 体内TIPS毒性试验

将体外LD₅₀转换为预测导致0%和100%大鼠死亡的TIPS剂量。通过TIPS在体内施用测试化学品。在3小时内（0, 1, 2, 和3小时）对大鼠进行四次给药。给药后，观察大鼠2周，以检测灌注化学品的急性毒性作用并观察实验动物的存活率。表中显示了源自体外LD₅₀、预测导致大鼠存活率为0%和100%的总TIPS剂量：这个假设包含体内LD₅₀的剂量范围是通过四次TIPS给药的总剂量。表中还显示了施用于大鼠的测试化学品剂量、大鼠存活率以及从存活曲线获得的TIPS LD₅₀值。

首先测试了1,4-二噁烷。随后对大鼠施用了2-乙氧基乙基乙酸酯、乙酰丙酮、1,2-二氯乙烷、甲基丙烯酸缩水甘油酯和二甲苯的四个剂量。对于甲基丙烯酸缩水甘油酯，初始剂量范围未包含体内LD₅₀，因此对第二组大鼠施用了0、120、240、480和960 mg/kg的甲基丙烯酸缩水甘油酯。在最后一系列实验中，对大鼠以2或4的倍数施用了缩水甘油、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、聚丙烯酸、丙烯醛和叔丁醇的三个剂量。初始给药范围未包含缩水甘油或叔丁醇的LD₅₀，因此对第二组大鼠施用了0、160、320和640 mg/kg的缩水甘油。对于叔丁醇，根据其他化学品的剂量反应强烈提示下一个更高剂量的叔丁醇会导致100%致死率，因此本研究未使用第二组大鼠，LD₅₀由初始施用叔丁醇的大鼠组推导得出。

3.3 报告的4小时吸入LC₅₀值与TIPS衍生LC₅₀值比较

测试化学品的急性吸入LC₅₀值显示于表中。将ppm值转换为mg/L，并将非4小时暴露的LC₅₀转换为4小时LC₅₀值。表中显示的TIPS LD₅₀值也转换为LC₅₀值。比较吸入LC₅₀值和转换后的TIPS LC₅₀值表明，在测试的12种化学品中，有9种化学品的吸入LC₅₀ mg/L值与转换后的TIPS LC₅₀ mg/L值相似。两种水溶性化学品N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二甲基乙酰胺的TIPS LD₅₀值显著高于吸入LC₅₀值，而测试的单一水不溶性化学品二甲苯的TIPS LD₅₀值低于吸入LC₅₀值。

3.4 报告的4小时吸入LC₅₀值与体外衍生LC₅₀值比较

将体外LD₅₀转换为300克大鼠的mg/kg剂量。将这些值乘以四以考虑四次给药，并使用与转换体内TIPS LD₅₀为mg/L相同的程序，转换为300克大鼠的mg/L值。体外LD₅₀的四剂量mg/L值显示于表中，旁边是吸入4小时LC₅₀ mg/L值以便比较。八种化学品（1,4-二噁烷、2-乙氧基乙基乙酸酯、乙酰丙酮、1,2-二氯乙烷、甲基丙烯酸缩水甘油酯、丙烯醛、聚丙烯酸聚合物和叔丁醇）的LD₅₀浓度在转换为TIPS LC₅₀ mg/L值时，与报告的吸入LC₅₀ mg/L值的差异在2.5倍以内。

4 讨论

本研究是一项初步的概念验证研究。测试了12种化学品，以探讨使用气管内灌注测定挥发性化学品急性吸入毒性的可能性。由于本研究中TIPS的载体是盐水，因此集中于FUJIFILM Wako Chemicals提供的可与水混溶的化学品及其溶液。

通过A549肺癌细胞体外暴露于递增量的测试化学品，确定了一个可能包含通过TIPS施用的化学品LD₅₀的剂量范围。对于12种化学品中的10种，该剂量范围包含了通过TIPS施用的测试化学品的LD₅₀。初步A549细胞体外暴露未包含其LD₅₀的两种化学品是甲基丙烯酸缩水甘油酯和缩水甘油。

对于甲基丙烯酸缩水甘油酯，通过A549体外测定确定的、预测经TIPS给药大鼠100%致死剂量为240 mg/kg。然而，通过TIPS施用该剂量并未导致任何大鼠死亡。这表明甲基丙烯酸缩水甘油酯的体内毒性远低于本研究中体外测定的预测。值得注意的是，甲基丙烯酸缩水甘油酯的吸入LC₅₀和通过TIPS确定的LC₅₀具有可比性。

另一种A549体外测定未能预测包含其TIPS LD₅₀的剂量范围的测试化学品是缩水甘油。对于缩水甘油，通过A549体外测定确定的、预测导致0%致死率的剂量为335 mg/kg。然而，通过TIPS施用该剂量导致100%致死率。这表明缩水甘油的体内毒性远高于本研究中体外测定的预测。值得注意的是，缩水甘油的吸入LC₅₀和TIPS LC₅₀具有可比性。

对于像缩水甘油这样的化学品，如果体外测定确定的最低量在体内比预期更具致死性，可以对一小批动物施用几个较低的测试化学品剂量。类似地，对于像甲基丙烯酸缩水甘油酯这样的化学品，可以施用几个较高的剂量。此外，为了减少动物测试，研究人员建议在急性吸入研究中存活下来的动物可以继续监测长达2年，用于慢性毒性/致癌性评估。

甲基丙烯酸缩水甘油酯体内毒性低于体外的一个可能原因是其在生理盐水中的溶解度影响了体内的致死性。然而，1,2-二氯乙烷在水中的溶解度与甲基丙烯酸缩水甘油酯大致相同，这表明除水溶性外还有其他因素影响了甲基丙烯酸缩水甘油酯的体内致死剂量。修改体外测定可能有助于更好地确定体内使用的最低和最高剂量。

八种化合物的转换后TIPS LC₅₀ mg/L值与吸入LC₅₀值非常相似，差异在2.5倍或以内。值得注意的是，四种化合物的吸入LC₅₀值在不同吸入研究中也存在超过2.5倍的差异。对于甲基丙烯酸缩水甘油酯，其TIPS LD₅₀比一项研究中报告的LC₅₀高出40倍以上。然而，另一项研究报告称，大鼠暴露于2.394 mg/L的甲基丙烯酸缩水甘油酯4小时未观察到死亡率，表明其LC₅₀可能远高于此值。这表明对于甲基丙烯酸缩水甘油酯，一旦其急性吸入毒性LC₅₀被确定，转换后的TIPS LC₅₀和吸入LC₅₀值很可能具有可比性。

在三种TIPS LC₅₀ mg/L值与吸入LC₅₀ mg/L值差异超过2.5倍的化学品中，有两种高于吸入值。N,N-二甲基甲酰胺的TIPS LC₅₀值约为吸入LC₅₀值的六倍，N,N-二甲基乙酰胺的TIPS LC₅₀值比吸入值高出10倍以上。这表明这些化学品通过TIPS给药的毒性远低于吸入给药的毒性。这两种化学品均可与水混溶，因此其低毒性的原因似乎与在盐水中的溶解度无关。值得注意的是，同样可与水混溶的1,4-二噁烷、缩水甘油、丙烯醛和叔丁醇的TIPS LD₅₀ mg/L值与吸入LD₅₀值吻合良好。目前可以推测，水性N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二甲基乙酰胺的毒性低于其气态蒸气。这种可能性需要进一步研究，如果成立，则需要确定不影响测试化学品毒性的TIPS载体。

另一种与吸入LC₅₀值不同的化学品是二甲苯。二甲苯的TIPS LC₅₀值低于吸入LC₅₀值。这表明通过TIPS给药的二甲苯比通过吸入暴露的毒性更强。一个因素是化学物质进入肺上皮内衬液体的实际吸收率预计会因环境因素和个体差异而变化。本研究在比较时假设了100%的吸收率，这一假设可能需要修正。因此，通过TIPS给药时，TIPS溶液中的二甲苯水平可能高于吸入暴露期间肺上皮内衬液体中吸收的水平，这会导致二甲苯与肺上皮细胞的相互作用增加，从而毒性增强。

尽管本研究的主要重点是探讨使用TIPS确定挥发性化学品急性吸入毒性的可能性，但值得注意的是，将体外LD₅₀转换为LC₅₀ mg/L值后，发现有八种化学品的转换后LC₅₀与报告的急性吸入LC₅₀差异在2.5倍以内。这表明有必要对使用体外实验评估急性吸入毒性进行进一步研究。

5 总结与未来方向

本研究是一项初步的概念验证研究，因此仅评估了12种挥发性化学品。TIPS LC₅₀值与已发表的吸入LC₅₀值之间的高度一致性表明，TIPS有潜力用于确定挥发性化学品的急性吸入毒性。

挥发性化学品的急性吸入毒性测试需要专用设备。因此，只有有限数量的设施能够进行此类研究。相比之下，将测试物质灌注到肺部基本上所有拥有毒理学研究设施的机构都可以进行。因此，气管内灌注给药的简便性以及所需材料量少，将显著增加能够进行急性吸入毒性测试的机构数量，这是开发气管内灌注作为确定挥发性化学品急性吸入毒性方法的一个主要动力。

计划未来使用更广泛的挥发性化学品进行进一步研究。此外，需要开展研究以确定适用于不同类型化学品的合适溶剂和不合适溶剂。同时，未来的研究将考虑用于测试化学品急性吸入毒性的大鼠的性别和年龄可能影响结果。

最后，有必要对使用体外实验评估急性吸入毒性进行进一步研究。重要的是，体外实验有潜力识别适用于TIPS的溶剂，以及适合和不适合使用TIPS确定急性吸入毒性的化学品。