生物学性别对发育期儿童免疫系统的细胞比例和表观遗传特征的影响

《Communications Biology》：Biological sex impacts immune cell proportions and epigenetic profiles in the developing pediatric immune system

本研究针对早期生命阶段免疫系统发育中性别差异机制不清的问题，通过分析加拿大CHILD队列1岁和5岁儿童的全血样本，利用DNA甲基化（DNAm）谱和计算细胞类型反卷积技术，揭示了免疫细胞比例随年龄的显著变化及稳定的性别特异性表观遗传特征。研究发现，在青春期前就已存在显著的免疫细胞比例和免疫相关基因DNAm的性别差异，且这些差异在独立儿科队列中得到验证，为理解生命早期免疫系统成熟及性别特异性健康差异的生物学基础提供了重要见解。

　　

在生命最初的几年里，人体的免疫系统经历着翻天覆地的变化，从母亲提供的被动保护逐渐过渡到成熟的自主免疫状态。这个快速发育的窗口期被认为是奠定一生健康轨迹的关键，然而，科学家们对这一时期免疫系统如何成熟，特别是男婴和女婴的免疫系统是否存在先天差异，仍知之甚少。众所周知，男性和女性在免疫反应和疾病易感性上存在差异，例如女性通常对疫苗接种产生更强的抗体反应，而男性则更容易受到严重细菌感染的威胁。但大多数相关研究都集中在青春期或成年期，此时性激素水平活跃，很容易将观察到的差异归因于激素的影响。那么，在性激素水平较低的童年早期，这种免疫差异是否已经存在？其背后的分子机制又是什么？为了解开这些谜团，一个由Karlie Edwards、Sarah M. Merrill等研究人员组成的国际团队进行了一项深入的研究，其成果发表在《Communications Biology》上。

研究人员利用加拿大健康婴儿纵向发展（CHILD）队列这一宝贵的资源，收集了760名儿童（356名女童，404名男童）在1岁和5岁时的静脉全血样本。他们采用了一种名为“表观遗传学”的利器来探究这个问题。表观遗传学可以被理解为基因的“开关系统”，它能在不改变DNA序列的情况下调控基因的活性。DNA甲基化（DNAm）是其中一种重要的表观遗传标记，就像附着在DNA分子上的“化学标签”，它的动态变化可以反映环境暴露、发育阶段乃至性别等因素的影响。通过使用Illumina甲基化EPIC芯片，研究人员高通量地测量了每个样本中超过86万个特定DNA位点（称为CpG位点）的甲基化水平。

为了开展这项研究，研究人员主要运用了几个关键技术方法。首先是利用Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip array version 1（EPICv1）对全血样本进行全基因组DNA甲基化谱分析。其次，采用基于DNAm的计算细胞类型反卷积算法，以IDOL-ext参考数据集为基准，推算了12种免疫细胞亚群的比例。此外，使用Illumina Infinium Global Screening Array+Psych Array（GSA v3+Psych v1）进行基因分型，并利用1000 Genomes Project数据进行遗传祖先推断以控制混杂因素。在数据分析方面，针对免疫候选基因列表（源自NanoString nCounter? immunology panel）中的4968个可变CpG位点，进行了位点特异性稳健线性回归分析，以关联DNAm变化与年龄及性别，并采用严格的统计学阈值（FDR < 0.05，|Δβ| > 0.03）筛选显著位点。最后，在GSE142512（1岁）和INMA（4岁）两个独立的儿科队列中对性别差异的发现进行了验证。

Estimated cell type proportions significantly changed in the first five years of life and exhibited sex-associated differences

研究人员首先关注了免疫系统的“士兵”——各种免疫细胞的比例变化。通过生物信息学算法对DNA甲基化数据进行分析，他们估算了12种免疫细胞类型在1岁和5岁时的比例。结果发现，所有被检测的免疫细胞类型，无论是先天免疫细胞（如中性粒细胞、单核细胞）还是适应性免疫细胞（如B细胞、T细胞），其比例在两个时间点之间均发生了显著变化。

这表明在生命最初的五年里，免疫系统确实在进行剧烈的“重组”和成熟。特别值得注意的是，适应性免疫细胞，如 na?ve B细胞、记忆B细胞、na?ve CD4⁺T细胞等的变化具有更大的效应量，反映了儿童在成长过程中接触外界环境后，免疫系统正在积累“记忆”。尽管大多数儿童表现出一致的发育轨迹，但个别细胞类型（如嗜酸性粒细胞）也显示出较大的个体差异。

更有趣的发现是关于性别差异。研究显示，在1岁和5岁时，男童和女童的免疫细胞比例就已经存在显著差异。在1岁时，嗜碱性粒细胞、CD4⁺记忆T细胞和调节性T细胞（Tregs）的比例在男女童间不同。到5岁时，差异进一步扩大，男童显示出更高比例的单核细胞，而女童则有更高比例的CD8⁺na?ve T细胞。

这些发现证实，在青春期之前，甚至在激素影响微弱的幼年时期，免疫系统的“硬件配置”——细胞组成，就已经因性别而异。

Immune-specific epigenome association study revealed age-and sex-associated DNAm signatures in the first five years of life

接下来，研究人员将目光投向了更微观的表观遗传层面。他们专门针对628个免疫系统候选基因区域的DNA甲基化变化进行了深入分析。与免疫细胞比例的显著变化形成对比的是，与年龄相关的DNA甲基化变化相对有限。在整个队列分析中，仅发现10个CpG位点（位于9个基因中）的甲基化水平在1岁到5岁期间发生了显著变化。这些基因包括与抗病毒免疫相关的NLRC5和参与抗原呈递的LAG3等。

当研究人员按性别分层分析时，发现男童和女童各有7个与年龄相关的显著CpG位点，但这些位点并不重叠。例如，在女童中，与细菌识别相关的NOD2基因的甲基化水平随年龄变化显著，这可能与女性在早期生命中通常表现出更强的先天免疫反应有关。而在男童中，负向调控I型干扰素的DHX58基因的甲基化变化更为明显，这可能与男性对病毒感染易感性较高的观察存在关联。

Validation of sex differences in DNAm

为了确保研究发现的可靠性，研究团队在两个独立的儿科队列中进行了验证。尽管用于验证的数据集使用的检测平台（450k array）覆盖的位点较少，且样本量相对较小，但结果仍然显示出高度的一致性。在1岁验证队列（GEO数据集）中，有15个CpG位点的性别差异得到了验证；在4/5岁验证队列（INMA队列）中，有16个位点得到验证。

所有测试位点在发现队列和验证队列中的效应大小（Δβ）均呈现极强的相关性（年龄1岁：R2 = 0.8；年龄5岁：R2 = 0.9）。这雄辩地证明了在儿童早期免疫系统中存在的性别特异性DNA甲基化差异是真实、稳定且可重复的。

综合以上研究结果，可以得出以下核心结论：儿童早期的免疫系统经历着剧烈的细胞组成变化，表现为适应性免疫细胞比例的显著调整，这反映了免疫系统为应对日益复杂的环境暴露而建立记忆的过程。更重要的是，研究发现，在青春期前，男童和女童的免疫系统在细胞比例和表观遗传层面就已存在显著且稳定的差异。这些差异并非由年龄增长主导，而是表现出性别特异性，并且其中很大一部分在独立队列中得到成功验证。

这项研究的意义重大。它首次在大型纵向儿科队列中，系统性地描绘了生命早期五年内免疫系统在细胞和表观遗传水平的发育图谱，并明确指出了性别是一个关键的影响因素。研究结果表明，男性和女性免疫系统的差异可能早在子宫内或婴儿期的“微小青春期”就已奠定基础，而非仅仅由青春期后的性激素驱动。这为理解男女在生命全程中免疫相关疾病易感性差异的发育起源提供了新的分子视角。例如，研究中发现的与炎症（如ALOX5）、先天免疫（如NOD2）和T细胞功能（如LAG3）相关的基因的性别特异性表观遗传特征，可能是未来探索性别特异性疾病预防和诊疗策略的重要靶点。此外，研究所建立的基于DNA甲基化估算免疫细胞比例和分析免疫相关表观遗传特征的方法，为在缺乏流式细胞术等传统检测手段的大规模人群研究中深入探索免疫发育提供了可行路径。总之，这项研究填补了我们对儿童早期免疫系统成熟过程中性别差异理解的空白，强调了在儿科研究和临床实践中考虑性别因素的重要性，并为未来开发针对性的早期干预措施以改善终身健康奠定了科学基础。