Cxcl9high巨噬细胞通过招募Cxcr3+浆母细胞促进狼疮性肾炎肾脏损伤的机制研究

本研究针对狼疮性肾炎( LN )中长寿命浆细胞( LLPCs )在肾脏异常增多的起源问题，通过单细胞RNA测序( scRNA-seq )和空间转录组学( ST )技术，发现肾脏驻留的Cxcl9high巨噬细胞及其分泌的趋化因子Cxcl9在疾病进展中显著升高，可招募外周血中Cxcr3+浆母细胞进入肾脏并分化为LLPCs产生自身抗体。该研究揭示了Cxcl9high巨噬细胞是诱导LN肾脏LLPCs增多的核心因素，为LN治疗提供了潜在新靶点。

　　

系统性红斑狼疮( SLE )是一种由自身抗体驱动的自身免疫性疾病，而狼疮性肾炎( LN )作为其最严重的并发症，是导致肾功能衰竭的主要原因。在LN患者的肾脏中，尤其是难治性或复发病例中，长寿命浆细胞( LLPCs )的数量显著增加，这些细胞是自身抗体的主要生产者。然而，LLPCs在LN肾脏中增多的原因和来源一直是个未解之谜。传统观点认为三级淋巴结构( TLS )可能是LLPCs的起源地，但近期研究发现LN患者肾脏中的B细胞并不能分化为LLPCs，这使问题变得更加复杂。

为了解决这一科学难题，研究人员在《Communications Biology》上发表了最新研究成果。他们利用自发性LN模型MRL/lpr小鼠，结合前沿的单细胞RNA测序( scRNA-seq )和空间转录组学( ST )技术，对LN肾脏中的免疫微环境进行了深入解析。

研究团队首先通过年龄分组( 4周、12周、20周 )模拟了人类LN的不同病理分级，发现随着疾病进展，小鼠的肾功能指标( 如24小时蛋白尿、血清肌酐等 )和自身抗体水平显著升高，肾脏病理损伤逐渐加重。利用10x Genomics单细胞测序平台，他们对87，906个肾脏细胞进行分析，鉴定出11个细胞亚群，包括T细胞、B细胞、浆细胞( PC )、巨噬细胞( Mφ )等。

通过对B细胞和浆细胞的进一步聚类分析，研究人员识别出8个细胞亚型：初始B细胞、记忆B细胞( MBC )、4种过渡型浆细胞( Trans PC1-4 )以及成熟浆细胞( PC1和PC2 )。其中Trans PC4表现出浆母细胞特征，PC1和PC2分别对应短寿命浆细胞( SLPCs )和长寿命浆细胞( LLPCs )。有趣的是，只有Trans PC4( 浆母细胞 )高表达细胞周期相关基因，表明其在肾脏中具有持续增殖和分化的能力。

功能富集分析显示，Trans PC4( 浆母细胞 )主要富集在DNA复制和细胞周期通路，而PC1( SLPCs )和PC2( LLPCs )则主要参与内质网蛋白质加工和蛋白质输出通路，表明它们在抗体生产和分泌中起关键作用。酶联免疫斑点( ELISPOT )实验证实，随着LN进展，肾脏中IgG分泌细胞数量逐渐增加。

为了探究LLPCs的来源，研究人员分析了细胞分化轨迹。结果显示Trans PC4( 浆母细胞 )可以分化为PC1( SLPCs )和PC2( LLPCs )，而肾脏中的初始B细胞和记忆B细胞增殖分化能力极低，表明LLPCs主要来源于循环中的浆母细胞而非局部B细胞分化。

那么，这些浆母细胞是如何被招募到肾脏中的呢？研究人员发现Trans PC4( 浆母细胞 )高表达趋化因子受体Cxcr3、Cxcr4、Ccr7和Ccrl2。通过检测相应配体的蛋白水平，发现只有Cxcl9在LN进展中显著升高。流式细胞术进一步证实，肾脏中Cxcr3⁺ Trans PC4的比例随LN进展逐渐增加。

通过细胞来源追踪，研究人员发现Cxcl9主要由肾脏中的巨噬细胞分泌。对巨噬细胞进行亚群分析后，鉴定出5个巨噬细胞亚型，其中Cxcl9^high巨噬细胞( 簇10 )特异性高表达Cxcl9，且其比例随LN进展显著增加。功能富集显示这些细胞主要参与防御反应、趋化作用、黏附和促炎反应。

空间转录组学分析揭示了细胞在肾脏中的精确定位。结果显示，在4周LN小鼠肾脏中未发现共定位斑点，而在12周和20周LN中，Cxcl9^high巨噬细胞和Cxcr3⁺浆母细胞在肾髓质动脉周围和皮质血管周围出现共定位。免疫荧光染色证实了巨噬细胞和浆细胞在肾脏间质中的血管周围分布，且几乎不涉及肾小球。

基于这些发现，研究人员进行了靶向治疗实验。从12周龄开始，每两周给LN小鼠腹腔注射抗Cxcl9抗体。结果显示，与对照组相比，抗Cxcl9抗体治疗显著降低了尿蛋白/肌酐比值( UPCR )和血清肌酐水平，减轻了肾脏免疫细胞浸润和肾小球损伤。流式细胞术分析表明，抗Cxcl9抗体抑制了Cxcr3⁺浆母细胞从外周循环向肾脏的迁移。

主要技术方法

本研究主要采用了MRL/lpr小鼠模型模拟人类LN病程，通过单细胞RNA测序( scRNA-seq )对87，906个肾脏细胞进行转录组分析，结合空间转录组学( ST )技术解析细胞空间分布，利用流式细胞术进行细胞表型验证，采用酶联免疫吸附试验( ELISA )检测趋化因子蛋白水平，通过酶联免疫斑点( ELISPOT )评估抗体分泌功能，并运用伪时间轨迹分析推断细胞分化关系。

研究结果

肾脏免疫反应随LN进展而增强

随着小鼠年龄增长，肾功能指标恶化，自身抗体水平升高，肾脏免疫复合物沉积和间质纤维化加重。根据ISN/RPS肾病理分类，4周、12周和20周LN小鼠分别对应人类LN的II级、III级和IV级病变。

LN肾脏细胞图谱变化

单细胞测序鉴定出11个细胞亚群，其中浆细胞比例随LN进展显著增加。B细胞和浆细胞的进一步分群揭示了8个细胞亚型，包括浆母细胞( Trans PC4 )、短寿命浆细胞( PC1 )和长寿命浆细胞( PC2 )。

浆母细胞和LLPCs功能活跃

功能分析显示浆母细胞主要参与细胞增殖和分裂，而LLPCs则专注于免疫球蛋白合成和分泌。ELISPOT实验证实IgG分泌细胞数量随疾病进展增加。

循环浆母细胞被招募至肾脏并分化为LLPCs

细胞周期和凋亡分析表明，只有浆母细胞具有持续增殖能力。分化轨迹分析证实浆母细胞可分化为LLPCs。代谢通路分析显示浆母细胞的糖酵解和氧化磷酸化活性最高。

Cxcl9通过其受体Cxcr3招募浆母细胞

浆母细胞高表达Cxcr3，而其配体Cxcl9在LN肾脏中蛋白水平显著升高。流式细胞术验证了Cxcr3⁺浆母细胞在肾脏中的比例增加。

肾脏驻留Cxcl9^high巨噬细胞是Cxcl9主要来源

巨噬细胞亚群分析发现Cxcl9^high巨噬细胞特异性高表达Cxcl9，其比例随LN进展增加。这些细胞表现出强烈的趋化能力。

巨噬细胞与浆细胞的空间共定位

空间转录组显示Cxcl9^high巨噬细胞与Cxcr3⁺浆母细胞在肾脏间质中相邻分布，尤其在血管周围。这种共定位随疾病进展从髓质扩展到皮质。

抗Cxcl9抗体治疗有效

抗Cxcl9抗体治疗显著改善了肾功能，减少了肾脏浆母细胞浸润，增加了外周循环中的浆母细胞数量。

结论与讨论

本研究通过整合单细胞测序和空间转录组学技术，首次揭示了Cxcl9^high巨噬细胞在LN肾脏LLPCs增多中的关键作用。这些巨噬细胞通过分泌Cxcl9，招募循环中Cxcr3⁺浆母细胞进入肾脏，进而分化为LLPCs并产生自身抗体。这一发现不仅解决了LN中LLPCs来源的长期争议，还为临床治疗提供了新思路。针对Cxcl9^high巨噬细胞的早期干预可能阻止浆母细胞向肾脏的迁移，减少LLPCs的积累，从而改善LN预后。该研究为开发针对难治性LN的靶向治疗策略奠定了理论基础。

研究的局限性在于仅使用了一种LN动物模型，需要在其他模型和患者肾活检标本中进一步验证。未来通过构建Cxcl9基因敲除模型，将能更清晰地阐明Cxcl9与LN进展的关系。总之，这项研究为理解LN发病机制提供了重要见解，为开发新的治疗策略指明了方向。