时间控制在线固相萃取新策略：复杂基质中N-乙酰乙醇胺定量分析的突破

本研究针对复杂生物基质中N-乙酰乙醇胺(NAEs)定量分析面临的技术挑战，开发了一种创新的时间控制在线固相萃取(Online SPE)与HPLC-MS/MS联用方法。研究人员通过优化六通阀切换时间，实现了PEA和OEA与脂质干扰物的高效分离，方法验证显示优异线性度(LOD: PEA 0.27 ng/mL, OEA 0.04 ng/mL)，首次报道了马血浆中内源性NAEs水平数据，为内源性大麻素系统研究提供了重要技术支撑。

　　

在生物医学研究领域，N-乙酰乙醇胺(N-acylethanolamines, NAEs)作为内源性大麻素系统的重要信号分子，正日益受到科学界的关注。这些脂质分子在调节代谢、免疫和疼痛处理等生理过程中发挥着关键作用，其水平变化与慢性疼痛、神经退行性疾病和炎症性疾病等多种病理状态密切相关。然而，准确量化生物体液中的NAEs水平一直面临着巨大挑战，特别是像血浆这样的复杂基质中含有大量磷脂、蛋白质和有机酸等干扰成分，这些物质与目标分析物具有相似的化学性质，使得传统分析方法往往力不从心。

以往的研究主要集中在小鼠和人类样本上，而对马这类重要家畜物种中NAEs的了解几乎空白。马血浆因其独特的组成而特别具有挑战性——高浓度的脂质干扰物与目标NAEs共享相似的疏水特性，使得常规的固相萃取(Solid Phase Extraction, SPE)方法难以奏效。传统在线SPE方法依赖于化学选择性，通过亲水性洗涤相去除极性干扰物，但对于化学性质相似的化合物则无能为力。这一技术瓶颈严重限制了对马内源性大麻素系统的深入研究，也阻碍了相关疾病生物标志物的开发。

为了解决这一难题，来自意大利卡塔尼亚大学的研究团队在《Journal of Chromatography A》上发表了一项创新性研究，开发了一种基于时间控制的新型在线SPE策略，成功实现了马血浆中两种重要NAEs——棕榈酰乙醇酰胺(Palmitoyl Ethanolamide, PEA)和油酰乙醇酰胺(Oleoyl Ethanolamide, OEA)的准确定量。

研究人员采用的关键技术方法主要包括：首先通过甲苯液液萃取(Liquid-Liquid Extraction, LLE)预纯化脂质类组分，然后创新性地将时间控制在线SPE与HPLC-MS/MS系统耦合，利用分析物与干扰物在色谱系统中的差异保留时间，通过精确控制六通阀切换时机实现选择性分离。方法验证严格遵循ICH Q2-R2和M10指南，对36匹健康赛马的血浆样本进行了定量分析。

4.1. 方法验证

4.1.1. 线性范围和检测限

研究方法在线性范围内表现出优异的性能，PEA和OEA的线性决定系数R²分别达到0.9994-0.9997和0.9992-0.9995。检测限(LOD)和定量限(LOQ)分别为：PEA 0.27 ng/mL和0.83 ng/mL，OEA 0.04 ng/mL和0.11 ng/mL，这些数值与已验证的血浆分析方法相当，确保了方法的灵敏度满足生物样本分析要求。

4.1.2. 准确度

通过回收率和基质效应评估方法的准确度。PEA在低、中、高三个浓度水平(7、10、20 ng/mL)的回收率分别为89.89%、103.35%和104.36%，OEA相应为104.20%、108.58%和113.75%。基质效应结果显示PEA为92.38-92.92%，OEA为84.70-87.77%，表明方法具有良好的准确度和抗基质干扰能力。

4.1.3. 精密度

精密度评估显示，日内和日间变异系数均低于6%，远低于可接受的15%标准，证明方法具有出色的重复性和再现性。这种高精密度对于生物标志物的可靠定量至关重要。

4.1.4. 残留效应

残留效应评估证实，在最高校准浓度后运行的空白样本中，分析物信号均低于LOD的10%，表明方法不存在显著的残留问题，适合高通量样本分析。

4.1.5. 统计分析-异常值

使用Dixon Q检验对OEA定量数据中的潜在异常值进行识别，在99%置信水平下确认并剔除了个别异常值，确保了数据的统计学可靠性。

4.2. 六通阀切换时间优化

研究人员通过系统实验确定了最优的阀切换时间。当切换时间为5分钟时，虽然分析物被成功转移，但脂质干扰物也同时到达分析柱，导致干扰物积累；切换时间缩短至3分钟时，OEA分析物未能完全转移，PEA峰面积显著降低；而4分钟的切换时间实现了最佳平衡——所有目标分析物被高效洗脱至分析柱，同时基质干扰物被保留在SPE柱上。这种时间控制的精确性成为方法成功的关键。

4.3. SPE策略性能

4.3.1. 常规SPE评估

传统SPE方法在马血浆样本中表现不佳，验证了化学选择性机制在分离化学性质相似化合物时的局限性，突出了时间控制策略的必要性。

4.3.2. 时间控制在线SPE的提取结果比较

对比分析显示，未经在线SPE处理的样本存在明显的保留时间漂移和峰面积变异，而采用时间控制在线SPE的样本则表现出优异的稳定性和重现性。应用新方法对36个马血浆样本的定量分析首次揭示了该物种中NAEs的基础水平：PEA为238.29 ± 70.10 nmol/L，OEA为6.74 ± 3.77 nmol/L。这些数值与已报道的人类和犬类数据存在显著物种差异，可能反映了代谢特征的特异性。

本研究的意义不仅在于首次报道了马血浆中内源性NAEs的水平数据，更重要的是提出了一种创新的分析策略。时间控制在线SPE代表了一种范式转变——从传统的基于化学选择性的分离方法转向时间依赖的纯化协议。这种方法成功解决了分析化学中的一个基本难题：从含有化学相似干扰物的复杂基质中纯化目标化合物。

该技术的应用前景广阔，可扩展到其他复杂生物基质的分析，如反兴奋剂研究中的生物标志物监测、炎症性疾病相关脂质介质的定量分析等。在制药、环境和临床分析领域，当基质复杂性影响分析性能时，这种时间控制原则都能提供有效的解决方案。

研究人员强调，甲苯液液萃取仍然是NAEs分离的首选方法，但其与时间控制在线SPE的协同使用在马血浆这种特殊基质中展现出独特优势。这种"联用"技术预处理策略有效中和了基质相关干扰，使方法最终能够成功验证用于马血浆中PEA和OEA等关键生物标志物的定量。

这项研究不仅增进了我们对马内源性大麻素系统的理解，也为复杂生物样本中化学相似化合物的分析提供了新的技术思路。随着对脂质信号分子重要性认识的不断深入，这种时间控制的纯化策略有望在生物标志物发现、疾病机制研究和治疗监测等领域发挥越来越重要的作用。