中空二氧化锰/铜掺杂碳点纳米平台重塑肿瘤微环境，从而增强免疫治疗效果

《Journal of Colloid and Interface Science》：Hollow manganese dioxide/copper-doped carbon dot nanoplatform reshapes the tumor microenvironment to enhance the immune therapy response

免疫检查点阻断疗法低响应率源于肿瘤微环境缺氧和PD-L1过表达，本研究通过“原位合成-模板蚀刻”策略构建HA修饰的空心锰 dioxide/CuCDs/MPPa纳米载体MCCMPH，实现氧气释放、HIF-1α/PD-L1轴抑制及PTT/CDT/PDT协同治疗，促进树突细胞成熟和T细胞浸润，联合抗PD-L1抗体显著抑制原发及转移瘤生长。

　　免疫检查点阻断（ICB）疗法在癌症治疗中展现出巨大的潜力，然而，患者的治疗反应率仍然较低，这主要受到肿瘤微环境（TME）中缺氧和免疫功能T细胞浸润不足的限制。HIF-1α介导的PD-L1高表达是影响ICB疗效的关键因素之一。为了解决这些问题，本研究创新性地采用了一种“原位合成-模板蚀刻”策略，构建了具有壳层结构的透明质酸修饰的空心二氧化锰纳米载体（MCCMPH）。该策略通过物理方式将铜掺杂的碳点（CuCDs）锁定在空心二氧化锰（HMnO?）的腔体内，有效解决了传统MnO?@CDs材料中碳点脱落的问题。纳米载体内部装载了光动力治疗（PDT）光敏剂甲基吡ropheophorbide a（MPPa）以及具有化学动力学治疗（CDT）和光热治疗（PTT）功能的CuCDs。

MCCMPH通过透明质酸（HA）对肿瘤细胞表面的CD44受体进行靶向修饰，实现了精准的药物递送。同时，HMnO?在肿瘤微环境中分解，释放氧气，改善缺氧状况，降低HIF-1α和PD-L1的表达水平，并为PDT提供必要的氧气底物。CuCDs的CDT和PTT作用与MPPa的PDT作用协同作用，通过消耗谷胱甘肽（GSH）来级联放大活性氧（ROS），显著增强了免疫原性细胞死亡（ICD）。体外和体内实验表明，MCCMPH能够促进树突状细胞（DCs）的成熟，引导肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）从M2型向M1型极化，并提高功能性CD4+和CD8+ T细胞在肿瘤组织中的浸润水平。在双肿瘤模型中，MCCMPH与ICB联合使用，可以显著抑制原发和转移性肿瘤的生长，证明了其在逆转免疫抑制性TME和提升ICB反应率方面的有效性。

癌症是一种严重威胁人类健康的重大疾病，传统的治疗方法如手术、化疗和放疗存在诸多局限。虽然手术在早期肿瘤治疗中效果显著，但往往难以彻底清除残留的肿瘤细胞。化疗和放疗缺乏肿瘤特异性，不仅会杀伤肿瘤细胞，还可能对正常组织造成严重损伤，引发诸如骨髓抑制和胃肠道毒性等不良反应。此外，长期使用这些治疗方法容易导致肿瘤药物耐受性，严重影响治疗效果。因此，开发更加高效、低毒性和具有肿瘤靶向性的癌症治疗策略已成为当务之急。

免疫治疗为癌症治疗提供了新的方向，其中免疫检查点阻断（ICB）疗法近年来备受关注。免疫检查点是免疫系统的重要调节机制，正常情况下，它们可以防止免疫细胞过度激活，维持免疫稳态，并避免自身免疫疾病的发生。然而，肿瘤细胞利用这一机制，驱动免疫检查点分子的过度表达和激活，从而抑制免疫细胞功能，实现免疫逃逸。在研究的免疫检查点中，程序性死亡蛋白1（PD-1）及其配体（PD-L1）以及细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）在肿瘤免疫逃逸中起着关键作用。ICB疗法使用特定抗体（如抗PD-1/PD-L1抗体和抗CTLA-4抗体）来阻断检查点信号通路，逆转免疫抑制状态，并重新激活抗肿瘤免疫反应。尽管ICB疗法前景广阔，但其在临床应用中仍受限于相对较低的患者反应率。这一现象的主要原因是肿瘤微环境中功能性T细胞的活性不足，因此，提高功能性T细胞的活性对于增强ICB疗效至关重要。

肿瘤微环境中的缺氧是导致ICB反应率低的另一个重要因素。肿瘤细胞的快速增殖会导致氧气供应不足。在缺氧条件下，肿瘤细胞会发生代谢重编程，产生大量乳酸和葡萄糖酸，进一步加剧微环境的酸化。这种缺氧和酸性的微环境会激活缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）。HIF-1α是一种调节与肿瘤进展相关的基因表达的转录因子。一方面，HIF-1α促进肿瘤血管生成以补偿氧气缺乏；另一方面，它会上调免疫抑制性分子如PD-L1的表达，帮助肿瘤细胞逃避T细胞介导的杀伤。此外，缺氧会抑制树突状细胞（DCs）的成熟和抗原呈递功能，降低其激活T细胞和启动适应性免疫反应的能力；同时，它还会促使肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）向免疫抑制性的M2表型极化，进一步抑制抗肿瘤免疫。因此，改善缺氧的肿瘤微环境和增强T细胞免疫活性是克服ICB反应率低的两个核心策略。

光动力治疗（PDT）、光热治疗（PTT）、化疗（CT）和化学动力学治疗（CDT）已被证明能够诱导肿瘤细胞的免疫原性死亡（ICD），从而增加T细胞的活性。ICD可以通过释放损伤相关分子模式（DAMPs）来触发全身免疫反应。当肿瘤细胞发生ICD时，它们会释放如高迁移率族蛋白1（HMGB1）、三磷酸腺苷（ATP）和钙网蛋白（CRT）等DAMPs到细胞表面或肿瘤微环境中。这些分子被树突状细胞等抗原呈递细胞识别后，可以促进树突状细胞的成熟和向T细胞呈递肿瘤抗原，从而激活先天性和适应性免疫反应，并显著提高功能性T细胞在肿瘤组织中的浸润水平。因此，设计能够高效诱导ICD并改善缺氧肿瘤微环境的治疗平台，已成为癌症ICB治疗领域的重要研究方向。

二氧化锰（MnO?）因其在肿瘤微环境中响应性释放氧气的能力而展现出优良的治疗特性，可以有效缓解缺氧导致的治疗抵抗、肿瘤转移和免疫抑制等问题。作为新型碳纳米材料，碳点（CDs）因其低毒性、良好的生物相容性、优异的光学性能和易于表面修饰等优点，在药物载体和荧光成像等领域展现出广阔的发展前景。铜掺杂的碳点（CuCDs）是一种功能性的纳米材料，通过在CDs表面引入铜元素（以离子或纳米颗粒形式），它结合了CDs的低毒性、良好生物相容性和优异光学性能，以及铜元素的催化活性（类芬顿反应）和靶向调控特性（如对谷胱甘肽（GSH）的调控），从而在抗肿瘤领域展现出多维度的应用潜力。例如，CuCDs可以高效地将近红外光能转化为热能，提高肿瘤局部温度，最终诱导肿瘤细胞凋亡；Cu2?具有过氧化物酶样活性，可以在肿瘤微环境中催化过氧化氢（H?O?）转化为高氧化性的羟基自由基（·OH），从而实现CDT介导的肿瘤杀伤。基于MnO?和CDs的抗肿瘤优势，由它们组合形成的多功能材料已成为联合肿瘤治疗研究的热点。然而，现有的MnO?@CDs复合材料在实际应用中仍存在显著的局限性。大多数研究采用“表面修饰法”来构建复合材料，即通过非共价键或物理相互作用直接在MnO?表面修饰CDs。例如，耿比江研究团队通过氢键将CDs修饰在空心二氧化锰（HMnO?）表面，制备的CDs@HMnO?能够有效激活适应性免疫反应，促进树突状细胞（DCs）的成熟，并随后启动细胞毒性T淋巴细胞的反应。李超研究团队则通过静电吸附的方式，依次在带负电荷的HMnO?壳层上修饰聚乙烯亚胺（PEI）和CDs，制备了HMnO?-PEI@CDs纳米复合材料。但由于CDs与HMnO?之间缺乏稳定的结合，这种制备方法在体内递送过程中容易导致CDs脱落。这不仅会降低材料的治疗效果，还可能暴露来自金属掺杂碳点的游离金属离子，带来潜在的生物毒性风险，严重影响材料的生物安全性和临床转化潜力。

为了解决上述问题，本研究创新性地开发了一种“原位合成-模板蚀刻”策略，构建了具有壳层结构的透明质酸修饰的空心二氧化锰/铜掺杂碳点/甲基吡ropheophorbide a纳米平台（MCCMPH）。该策略通过物理方式将铜掺杂的碳点（CuCDs）锁定在空心二氧化锰（HMnO?）的腔体内，从根本上解决了现有材料中碳点脱落的问题，显著提高了材料的生物安全性和体内稳定性。此外，通过透明质酸（HA）的靶向修饰（针对肿瘤细胞表面的CD44受体），结合MnO?对肿瘤微环境的响应性氧气释放、CuCDs的荧光/光热成像和CDT/PTT效应，以及MPPa的PDT效应，MCCMPH构建了一个“成像引导-氧气释放以抑制HIF-1α/PD-L1轴-CDT/光疗-免疫调控”的协同治疗系统，最终提升了ICB的治疗反应率。MCCMPH与免疫检查点阻断剂（如抗PD-L1抗体，αPD-L1）联合使用，能够有效抑制远处肿瘤的生长。通过整合靶向递送、级联治疗和全身免疫激活，MCCMPH为改善缺氧和免疫抑制性肿瘤微环境、提高ICB反应率提供了新的策略，并展现出良好的临床转化潜力。MCCMPH的合成过程和抗肿瘤机制如方案1所示。

在合成MCCMPH的过程中，首先采用水热法制备了负载CuCDs的空心介孔二氧化硅（HSiO?）纳米复合材料（HSiO?@CuCDs）。在此过程中，使用HSiO?作为模板，铜葡萄糖酸盐和叶酸（FA）作为前驱体，铜离子被复合在CDs的表面。随后，将KMnO?与HSiO?@CuCDs混合，残留在HSiO?表面的有机物可将KMnO?还原，并在HSiO?@CuCDs表面形成HMnO?壳层。最后，使用Na?CO?溶液蚀刻HSiO?模板，得到HMnO?@CuCDs复合物。接着，将HMnO?@CuCDs与MPPa混合并自组装，最终通过透明质酸（HA）修饰表面，获得目标纳米结构MCCMPH。

CuCDs的制备过程也至关重要。首先，将80毫克叶酸和100毫克铜葡萄糖酸盐超声分散在100毫升纯水中10分钟，随后将分散液转移至200毫升反应釜中，在180摄氏度下加热8小时。反应结束后，在室温下以12000转/分钟的速度离心10分钟，收集沉淀物。将沉淀物置于纯水中，使用截留分子量为1000 Da的透析袋进行透析72小时，以去除未反应的小分子。透析后的残留物通过离心进一步纯化，得到CuCDs。

本研究通过创新的合成策略和结构设计，成功构建了MCCMPH纳米平台，为解决ICB疗法中的关键问题提供了新的思路。该平台不仅具有优异的靶向性和稳定性，还能通过多模态治疗方式（PDT、CDT、PTT）协同作用，显著增强免疫反应，提高治疗效果。此外，MCCMPH的制备方法和治疗机制均展现出良好的生物相容性和临床转化潜力，为未来的癌症治疗研究提供了重要的参考和启示。