精准治疗tRNA通读拯救KCNJ13无义突变R166X恢复钾通道功能

本研究针对由KCNJ13基因R166X无义突变（CGA→TGA）引起的Leber先天性黑蒙症（LCA16）和雪花样玻璃体视网膜变性（SVD），探索了传统基因组编辑技术（如CRISPR-Cas9、碱基编辑、引物编辑）在纠正该突变时面临的挑战。研究人员开发了稳定的HEK293T R166X突变细胞系模型，并首次系统比较了基因组编辑与反密码子工程化tRNA（ACE-tRNAArg.UGA）的治疗效果。结果表明，3XCCT ACE-tRNAArg.UGA微环能够有效通读UGA终止密码子，恢复全长Kir7.1蛋白的膜表达和钾通道功能（电流从-58.14 pA提升至-108.34 pA，静息膜电位从-5.75 mV超极化至-40.89 mV），为难以通过基因组编辑纠正的突变提供了精准的翻译水平治疗新策略。

　　

在遗传性眼病的研究领域，由基因突变导致的视网膜病变一直是科学家们攻坚的重点。其中，KCNJ13基因编码的Kir7.1钾离子通道对维持视网膜色素上皮细胞的功能至关重要。该基因的突变会引发Leber先天性黑蒙症16型（LCA16）和雪花样玻璃体视网膜变性（SVD），导致患者早年即出现严重的视力丧失。在众多突变类型中，无义突变尤为棘手，它会在信使RNA中引入一个提前出现的终止密码子，导致蛋白质合成中途停止，产生截短且无功能的蛋白。R166X便是KCNJ13基因中这样一个典型的无义突变，它将编码精氨酸的CGA密码子变成了终止密码子TGA。

传统的基因增强疗法和基因组编辑技术（如CRISPR-Cas9）为纠正错义突变带来了希望，但对于像R166X这样的无义突变，科学家们还需要探索其他途径，例如翻译通读疗法，让核糖体“忽略”这个提前出现的停止信号，继续合成完整的蛋白质。然而，试图在人类诱导多能干细胞中创建R166X突变模型的研究却遇到了意想不到的阻碍，这可能与目标基因位点的染色质结构和折叠方式难以被编辑工具触及有关。这就提出了一个关键问题：当基因组编辑此路不通时，我们还能用什么方法来拯救因无义突变而失效的蛋白质功能？这项发表在《The Journal of Precision Medicine: Health and Disease》上的研究，正是为了回答这个问题而展开的。

为了攻克这一难题，来自威斯康星大学麦迪逊分校的研究团队采取了一种巧妙的策略。他们首先绕过了在hiPSC中直接编辑基因的困难，转而利用FLP-FRT重组酶技术，构建了能够稳定表达野生型或R166X突变型KCNJ13基因的HEK293T细胞系，从而建立了一个易于操作的体外疾病模型。随后，他们系统地评估了三种前沿的基因组编辑技术——常规基因编辑、碱基编辑和引物编辑——在纠正这一突变上的效率。在发现这些方法均效果不佳后，研究重点转向了一种更具前景的翻译水平解决方案：反密码子工程化tRNA。研究人员设计并测试了六种不同结构的精氨酸ACE-tRNA^Arg.UGA微环，旨在让它们携带正确的精氨酸，专门识别并通读R166X位点的UGA终止密码子。研究的关键技术方法包括：利用CRISPR-Cas9及相关编辑工具尝试在细胞系中进行基因修正；构建稳定的HEK293T突变细胞系作为研究模型；通过流式细胞术和荧光显微镜评估ACE-tRNA对报告基因GFP^TGA的通读效率；采用免疫细胞化学法检测Kir7.1全长蛋白的表达和膜定位；最后，运用全细胞膜片钳技术精确测量钾离子通道的功能恢复情况。

生成R166X体外人类疾病模型

研究人员最初尝试利用CRISPR-Cas9技术在hiPSC中引入R166X突变，但尽管经过多次努力和不同sgRNA的尝试，通过Inference of CRISPR Edits分析均显示编辑效率为0%，未能成功创建突变细胞系。在成纤维细胞中的尝试同样失败。因此，研究团队转变策略，通过将包含R166X突变的KCNJ13基因开放阅读框稳定整合到HEK293T细胞中，成功构建了HEK FRT R166X细胞系，并通过对该细胞系的测序验证了突变TGA密码子的正确插入，为后续治疗方法的测试提供了可靠的平台。

使用基因组编辑低效纠正R166X突变

在获得稳定的突变细胞系后，研究人员评估了三种基因组编辑技术的纠正能力。CRISPR-Cas9介导的常规基因编辑结合单链寡核苷酸模板，未能检测到任何有效的编辑。腺嘌呤碱基编辑器在一例样本中通过核转染RNP复合物达到了10%的编辑效率，但无法重复，效率过低难以进行功能验证。而更为精确的引物编辑技术，尽管经过精心设计pegRNA和ngRNA，同样未能产生可检测的编辑效果。这些结果表明，R166X位点对于现有的基因组编辑工具而言是一个难以攻克的靶点。

使用ACE-tRNA^Arg.UGA微环成功抑制PTC

鉴于在DNA水平上纠正突变的低效性，研究转向了在翻译水平上实现通读的策略。为了避免氨基糖苷类等小分子通读药物的脱靶效应和毒性，研究选用了ACE-tRNA疗法。研究人员设计并合成了六种不同异解码器结构和拷贝数的ACE-tRNA^Arg.UGA微环。通过将其与含有UGA终止密码子的绿色荧光蛋白报告质粒共转染HEK293细胞，利用流式细胞术和荧光显微镜检测GFP荧光来评估通读效率。结果显示，所有六种微环均能不同程度地通读UGA终止密码子，其中包含三个CCT异解码器拷贝的3XCCT ACE-tRNA^Arg.UGA效果最为显著，分别有42.5%（流式）和38%（镜检）的细胞显示出GFP荧光，因此被选用于后续对R166X突变的拯救实验。

3XCCT ACE-tRNA^Arg.UGA抑制R166X导致全长Kir7.1蛋白表达

接下来，研究验证了3XCCT ACE-tRNA^Arg.UGA能否在R166X突变背景下指导合成全长的Kir7.1蛋白。将GFP标记的R166X突变质粒与3XCCT ACE-tRNA^Arg.UGA微环以1:3的比例共转染细胞后，通过免疫细胞化学使用针对Kir7.1羧基端的抗体进行检测。结果显示，与仅表达R166X突变质粒的细胞相比，经ACE-tRNA处理的细胞成功表达了全长的Kir7.1蛋白，并且该蛋白至少部分地被运输到了细胞膜上。GFP标记的蛋白（绿色）与C端抗体标记的蛋白（红色）之间的共定位分析进一步证实了通读后产生的完整蛋白的存在。由于Kir7.1通道是同源四聚体，这表明通读产生的野生型亚基有可能与未被通读的突变型截短亚基共同组装成异源四聚体通道，并实现膜定位。

使用3XCCT ACE-tRNA^Arg.UGA实现R166X突变的功能性拯救

最关键的一步是检验通读产生的蛋白是否具有功能。研究人员通过全细胞膜片钳技术记录了钾离子电流。结果表明，与仅表达R166X突变的细胞相比，共转染R166X质粒和3XCCT ACE-tRNA^Arg.UGA的细胞，其钾离子电流显著增加。在-150 mV电压下，突变体的中位电流从-58.14 pA提升至-108.34 pA。静息膜电位也发生了显著的超极化，从-5.75 mV变为-40.89 mV，更接近野生型通道的-60.60 mV。为了特异性增强Kir7.1电流并进行更清晰的对比，研究使用了细胞外铷离子处理。结果显示，ACE-tRNA处理组的铷离子电流远高于突变体对照组，其电流增强倍数与野生型通道相似。这些电生理数据有力地证明，3XCCT ACE-tRNA^Arg.UGA不仅通读了终止密码子，表达出全长蛋白，更部分恢复了Kir7.1钾离子通道的核心功能。

本研究得出结论，针对KCNJ13基因的R166X无义突变，传统的基因组编辑技术在创建疾病模型和纠正突变方面均面临巨大挑战，提示该基因组位点可能存在特殊的可及性困难。而翻译水平的ACE-tRNA通读疗法则展现出巨大潜力。研究首次系统比较了多种基因组编辑方法与ACE-tRNA对同一无义突变的效果，并证实了3XCCT ACE-tRNA^Arg.UGA能够有效通读UGA终止密码子，实现Kir7.1蛋白的膜表达和部分功能恢复。尽管由于可能形成野生型与突变型亚基混合的异源四聚体通道，功能恢复尚未达到完全野生型水平，但这一策略的成功为治疗由无义突变引起的遗传病，特别是那些难以通过基因组编辑纠正的病例，提供了一种精准、基因非依赖性且可能脱靶效应更低的新途径。这项研究不仅为Leber先天性黑蒙症和雪花样玻璃体视网膜变性的治疗带来了新希望，也凸显了在精准医疗中，当一种技术路径受阻时，灵活转向其他分子水平进行干预的重要性。