锰负载碳纳米颗粒通过抑制铁死亡改善ANCA相关性血管炎的作用机制研究

本研究针对ANCA相关性血管炎（AAV）中中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）诱导的肾小球内皮细胞损伤机制，开发了锰负载葡萄糖碳纳米颗粒（GCNPs/Mn）。研究发现NETs通过抑制锰超氧化物歧化酶（MnSOD）活性诱发铁死亡（ferroptosis），而GCNPs/Mn通过溶酶体释放锰离子增强MnSOD活性，抑制NF-κB信号通路，显著改善实验性血管炎模型的肾功能损伤和脂质过氧化，为AAV治疗提供了新型纳米靶向策略。

　　

抗中性粒细胞胞质抗体（ANCA）相关性血管炎是一种危及生命的系统性自身免疫性疾病，其中肾脏是最常受累的器官之一，ANCA相关性肾小球肾炎（ANCA-GN）可导致快速肾功能衰退。尽管当前采用糖皮质激素联合细胞毒性药物治疗，但仍面临高死亡率和复发率的挑战。这种疾病的特征性改变是血管内皮细胞损伤，特别是肾小球内皮细胞（GEnCs）的损伤。近年研究发现，中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）在AAV发病机制中扮演重要角色，但其导致血管内皮细胞损伤的具体机制尚不完全清楚。

Wang等人在《Journal of Nanobiotechnology》上发表的研究发现，NETs通过诱导铁死亡（ferroptosis）——一种新发现的调节性细胞死亡形式——来介导肾小球内皮细胞损伤。研究人员在ANCA-GN患者和实验性血管炎模型中都观察到NETs水平显著升高，且与内皮细胞损伤标志物呈正相关。机制上，NETs通过抑制锰超氧化物歧化酶（MnSOD）活性，加剧氧化应激，诱导线粒体功能障碍，从而导致肾小球内皮细胞发生铁死亡。

为应对这一挑战，研究团队合成了锰负载葡萄糖碳纳米颗粒（GCNPs/Mn），这种新型纳米材料具有良好的生物相容性和抗氧化特性。体外实验表明，GCNPs/Mn能够恢复MnSOD活性，减轻线粒体功能障碍，抑制NF-κB信号通路，逆转NETs诱导的铁死亡。在ANCA-GN大鼠模型中，GCNPs/Mn给药显著减轻了肾损伤、脂质过氧化和铁死亡相关蛋白的失调。

研究采用的主要技术方法包括：从ANCA-GN患者和健康对照者分离中性粒细胞并检测NETs释放能力；建立MPO-AAV和PTU-AAV两种实验性血管炎大鼠模型；合成并表征GCNPs/Mn纳米材料；通过细胞活力检测、线粒体膜电位测定、活性氧和脂质过氧化水平检测评估细胞铁死亡；使用Western blot分析铁死亡相关蛋白表达；通过免疫荧光染色观察组织病理学变化。

NETs在AAV患者和大鼠中升高并与内皮细胞损伤相关

研究发现ANCA-GN患者中性粒细胞释放NETs的能力和血清cf-DNA水平显著高于健康对照组，肾组织免疫荧光染色显示肾小球NET标志物MPO和NE表达增加。在实验性血管炎大鼠模型中也观察到血清NETs水平显著升高。相关性分析显示血清NETs水平与内皮细胞损伤标志物ICAM-1和VCAM-1呈正相关。

铁死亡存在于ANCA-GN进展过程中

ANCA-GN患者血清铁蛋白和MDA水平显著升高，MnSOD活性显著降低。血清cf-DNA水平与MDA水平呈正相关，MnSOD活性与MDA水平呈负相关。肾组织免疫荧光显示肾小球TFR1表达增加，Western blot分析显示血管炎大鼠肾组织中促铁死亡蛋白TFR1和COX2表达上调，而抗铁死亡蛋白GPX4表达下调。

NETs通过铁死亡和降低MnSOD活性诱导内皮损伤

NETs处理显著降低内皮细胞线粒体膜电位，加剧细胞氧化应激和脂质过氧化，铁死亡抑制剂Fer-1可逆转这些变化。Western blot显示NETs处理导致铁死亡促进蛋白TFR1和COX2表达增加，铁死亡抑制蛋白GPX4表达减少。NETs还增加内皮细胞LDH释放和ICAM-1、VCAM-1表达，Fer-1干预可减轻NETs介导的内皮细胞损伤。

GCNPs/Mn的合成与表征

研究人员通过水热法合成GCNPs，然后通过氧化还原反应加载锰制备GCNPs/Mn。表征结果显示GCNPs和GCNPs/Mn均为离散球形，平均尺寸分别为37.4和37.5nm。FT-IR和XPS分析证实锰成功负载到GCNPs上，GCNPs/Mn具有清除超氧阴离子和羟基自由基的能力，且在酸性条件下锰容易从纳米材料中释放。

GCNPs/Mn抑制NETs诱导的GEnCs铁死亡

GCNPs/Mn在浓度高达100μg/mL时无明显细胞毒性，能有效进入细胞并在细胞内保持高浓度。GCNPs/Mn干预显著恢复了NETs引起的细胞活力下降，改善了线粒体膜电位，降低了总细胞内ROS和脂质过氧化水平，减少了MDA和铁含量，调节了铁死亡相关蛋白表达。

GCNPs/Mn通过抑制铁死亡减轻NETs介导的GEnCs损伤

GCNPs/Mn supplementation显著降低了NETs刺激引起的LDH释放，改善了内皮细胞单层通透性，恢复了紧密连接蛋白ZO-1的荧光强度，降低了ICAM-1和VCAM-1的蛋白水平，表明确实能够减轻NETs诱导的内皮细胞损伤。

GCNPs/Mn通过MnSOD/NF-κB信号通路减轻NETs诱导的GEnCs铁死亡

NETs干预降低了MnSOD活性，而GCNPs/Mn显著恢复了MnSOD活性。Confocal显微镜显示GCNPs/Mn主要存在于溶酶体中，ICP-MS检测证实细胞内锰浓度在GCNPs/Mn处理后显著增加。MnSOD敲低实验表明MnSOD活性影响内皮细胞铁死亡，GCNPs/Mn的保护作用依赖于MnSOD活性。RNA-seq和Western blot分析显示GCNPs/Mn抑制NF-κB信号通路激活。

GCNPs/Mn通过抑制铁死亡减轻实验性血管炎大鼠的肾损伤

静脉注射GCNPs/Mn的溶血率低于5%，且对主要器官无明显毒性。ICP-MS分析显示GCNPs/Mn优先在肾脏积累。在MPO-AAV和PTU-AAV大鼠模型中，GCNPs/Mn治疗显著改善了肾功能指标（BUN、Scr）、尿蛋白和血尿水平，减轻了肾组织病理损伤，降低了氧化应激、脂质过氧化和铁超载，改善了肾小球内皮细胞超微结构，增强了肾组织MnSOD活性，调节了铁死亡相关蛋白表达，抑制了NF-κB信号通路激活。

本研究揭示了NETs通过抑制MnSOD活性诱导肾小球内皮细胞铁死亡的新机制，为ANCA相关性血管炎的发病机制提供了重要见解。研发的GCNPs/Mn纳米材料通过溶酶体释放锰离子，增强MnSOD活性，抑制NF-κB信号通路，有效减轻NETs诱导的内皮细胞铁死亡和损伤。在实验性血管炎模型中，GCNPs/Mn治疗显著改善了肾功能和组织病理学变化，表明其作为一种新型纳米治疗策略的潜力。这些发现不仅深化了对AAV发病机制的理解，也为开发针对铁死亡的治疗方法提供了新思路，具有重要的临床转化价值。