基于外膜囊泡的纳米调节剂通过调控中性粒细胞N1极化和搭便车递送增强癌症免疫治疗

本研究针对癌症治疗中免疫细胞药物递送效率低和肿瘤微环境免疫抑制的难题，开发了一种新型OMVs（外膜囊泡） camouflaged纳米调节剂（OMV@PCB NPs）。该研究通过光动力疗法（PDT）诱导中性粒细胞（NEs）招募并利用其搭便车递送特性，同时通过TGF-β抑制剂SB525334促进NEs向抗肿瘤N1表型极化，实现协同免疫-光动力治疗，显著抑制肿瘤生长并改善免疫微环境，为癌症治疗提供新策略。

　　

癌症免疫治疗近年来成为肿瘤治疗领域的热点，尤其是细胞免疫疗法如CAR-T技术已在B细胞淋巴瘤治疗中取得突破。然而，T细胞衰竭、靶抗原表达不足、肿瘤部位T细胞浸润困难以及免疫应答不足等问题严重限制了其广泛应用。中性粒细胞（NEs）作为先天免疫的关键组成部分，能够迁移至肿瘤部位并被极化为抗肿瘤的N1表型或促肿瘤的N2表型。其中，N1中性粒细胞释放的中性粒细胞弹性蛋白酶（ELANE）可通过蛋白酶解释放CD95死亡结构域，选择性杀死多种癌细胞并引发凋亡途径，同时释放肿瘤特异性抗原从而激发体内适应性免疫应答。但肿瘤微环境（TME）中的免疫抑制分子转化生长因子β（TGF-β）会导致中性粒细胞极化为促肿瘤的N2表型，削弱T细胞的抗肿瘤活性。因此，阻断TGF-β信号成为促进中性粒细胞向N1表型极化的潜在策略。

另一方面，细胞搭便车递送治疗药物在靶向递送和增强肿瘤蓄积方面展现出巨大潜力。光动力疗法（PDT）不仅可通过光敏剂产生活性氧（ROS）杀死肿瘤细胞，还能促进T淋巴细胞浸润增强抗肿瘤免疫力。此外，PDT诱导的急性炎症可刺激中性粒细胞增殖并招募至炎症肿瘤部位，为基于中性粒细胞的搭便车递送策略提供可能。然而，传统体外搭便车策略存在中性粒细胞寿命短、成本高和流程复杂等问题，而原位搭便车策略虽更具应用前景，但开发通用有效的方法特异性搭便车循环中性粒细胞仍面临挑战。

细菌外膜囊泡（OMVs）源自革兰氏阴性菌（如大肠杆菌），具有丰富的病原体相关分子模式（PAMP）如脂蛋白和脂多糖（LPS），能有效激活先天和适应性免疫应答。此外，OMVs上表达的LPS可被中性粒细胞上的Toll样受体（TLR）特异性识别，从而增强中性粒细胞对OMVs的摄取。因此，OMVs包被的纳米平台在PDT辅助的中性粒细胞搭便车递送方面具有显著潜力。

在此背景下，研究人员开发了一种基于OMVs的纳米调节剂（OMV@PCB NPs），用于搭便车递送药物并极化中性粒细胞至抗肿瘤N1表型，从而抑制肿瘤生长。具体而言，将光敏剂氯e6（Ce6）和TGF-β抑制剂SB525334封装在聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米颗粒（NPs）中，然后通过OMVs包被形成OMV@PCB NPs。该纳米调节剂不仅继承了OMVs的生物学特性，可激活免疫应答并被中性粒细胞识别用于搭便车递送，还能在光照射下通过PDT产生大量ROS杀死肿瘤细胞，同时放大肿瘤部位的炎症因子刺激中性粒细胞招募，从而通过搭便车中性粒细胞增强肿瘤蓄积。此外，释放的SB525334有效阻断TGF-β信号，促进中性粒细胞向抗肿瘤N1表型极化，不仅通过释放ELANE选择性杀死癌细胞，还能逆转免疫抑制肿瘤微环境提升抗癌免疫力，实现有效的免疫-光动力治疗。

研究采用的关键技术方法包括：从大肠杆菌（DH5α）中提取OMVs并通过超速离心纯化；通过乳化-溶剂挥发法制备载药PLGA纳米颗粒（PCB NPs），并优化OMVs与PCB NPs的重量比以形成稳定包被；利用动态光散射（DLS）和透射电镜（TEM）表征纳米颗粒的粒径、电位和形态；通过流式细胞术（FCM）和共聚焦显微镜（CLSM）分析中性粒细胞对纳米颗粒的摄取和极化表型；通过体内外荧光成像评估肿瘤蓄积和药物递送效率；借助Western blot、qRT-PCR和免疫组化分析TGF-β信号通路及中性粒细胞表型标志物表达；通过MTT法、凋亡检测和体内肿瘤生长抑制实验评价抗肿瘤效果。

Preparation and characterization

OMV@PCB NPs成功制备，核心为载Ce6和SB525334的PLGA纳米粒（PCB NPs，粒径97 nm，电位-12 mV），经OMVs包被后粒径增至110 nm，呈现核心-壳结构，SDS-PAGE证实保留了OMVs特征蛋白。纳米颗粒在PBS中稳定性良好，至少可保存8天。

PDT-induced inflammation and NEs recruitment

PDT处理（660 nm光照）可显著升高肿瘤部位IL-6和TNF-α水平，诱导系统性炎症反应，并促进CD11b⁺ Ly6G⁺中性粒细胞在肿瘤部位招募，光照组比例较未光照组提高2.2倍。

NEs targeting

OMV@PCB NPs凭借OMVs特性被中性粒细胞高效识别和摄取，流式与共聚焦结果显示其细胞摄取率比未包被PCB NPs提高3.0倍。

Tumor accumulation by NPs-hitchhiked NEs

体内实验证实，OMV@PCB NPs在PDT辅助下通过中性粒细胞搭便车递送显著增强肿瘤蓄积，荧光成像显示肿瘤部位信号强度显著高于对照组，且经中性粒细胞耗竭后蓄积效果大幅减弱。

Intercellular transportation in vitro and in vivo

在PMA模拟的炎症环境下，OMV@PCB NPs可从中性粒细胞释放并被肿瘤细胞摄取，流式分析显示PDT处理后肿瘤细胞内纳米颗粒比例显著升高。

Antitumor efficacy in vitro

OMV@PCB NPs在光照下产生大量ROS，协同SB525334发挥显著抗肿瘤效果，诱导37.3%的细胞凋亡，显著高于各对照组。

Antitumor efficacy in vivo

在4T1肿瘤模型中，OMV@PCB NPs联合PDT处理显著抑制肿瘤生长，抑制率最高，生存期延长，肿瘤组织可见大量细胞死亡和凋亡。

Mechanism of NEs polarization

Western blot显示OMV@PCB NPs有效抑制TGF-β下游p-SMAD2磷酸化；流式和qRT-PCR证实N1表型标志物（CD54、CD95、Fas、CCL3）表达上调，N2标志物（CCL2、CCL5）下调；免疫组化显示ELANE和组蛋白H1.0表达增强，表明中性粒细胞向N1表型极化并通过ELANE释放选择性杀死肿瘤细胞。

OMV@PCB NPs-enhanced anticancer immunity

OMV@PCB NPs处理促进树突状细胞（DCs）成熟（CD80⁺ CD11c⁺和CD86⁺ CD11c⁺比例升高），增强CD4⁺和CD8⁺ T细胞浸润，提升细胞因子（IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ）分泌，同时降低免疫抑制性Treg细胞和髓源性抑制细胞（MDSCs）比例，显著改善肿瘤免疫微环境。

研究结论表明，OMV@PCB NPs成功整合了OMVs包被的PLGA纳米颗粒搭载TGF-β抑制剂和光敏剂的优势，通过PDT诱导炎症招募中性粒细胞并借助其搭便车递送增强肿瘤蓄积，同时利用SB525334抑制TGF-β信号促进中性粒细胞向N1表型极化，协同实现免疫-光动力治疗。该策略不仅通过ROS和ELANE高效杀死肿瘤细胞，还逆转免疫抑制微环境增强抗癌免疫力，为癌症治疗提供了新途径。论文发表于《Journal of Nanobiotechnology》，具有重要的理论价值和临床应用前景。