牙龈卟啉单胞菌胞外囊泡通过破坏线粒体动力学和抑制Cpt2介导的脂肪酸氧化加剧骨质疏松症

本研究揭示了牙周炎关键病原体牙龈卟啉单胞菌（Pg）来源的胞外囊泡（EVs）通过系统循环迁移至骨髓腔，被成骨细胞内存后破坏线粒体动力学平衡（促进Drp1/Fis1介导的线粒体分裂、抑制Mfn1/Opa1介导的线粒体融合），导致线粒体碎片化和功能损伤，进而下调肉碱棕榈酰转移酶2（Cpt2）表达，抑制脂肪酸氧化（FAO）代谢通路，最终阻碍成骨细胞分化和骨形成过程。该研究为牙周病与系统性骨质疏松的关联机制提供了创新性实验证据。

　　

背景

牙周炎（PD）是一种以牙槽骨吸收为特征的牙周组织炎症性疾病，而骨质疏松症（OP）则是以骨密度和骨质量下降为特征的全身性骨骼疾病。近年研究表明牙周炎是骨质疏松的潜在风险因素，但其具体机制尚未明确。牙龈卟啉单胞菌（Pg）作为牙周炎的关键致病菌，能够分泌胞外囊泡（EVs）。本研究通过与毒力较低的同类菌株牙髓卟啉单胞菌（Pe）的EVs进行比较，探究Pg EVs是否能够转运至骨髓腔并影响骨质疏松相关的成骨细胞分化过程。

材料与方法

研究采用透射电镜（TEM）和扫描电镜（SEM）对Pg和Pe细菌及其EVs的形态进行表征，通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）测定EVs粒径分布。使用银染和Western blot（WB）分析EVs的蛋白组成，并通过质谱鉴定特异性蛋白。通过腹腔注射DiR标记的EVs进行体内追踪实验，采用激光共聚焦显微镜观察EVs被成骨细胞内存的途径。建立卵巢切除（OVX）诱导的骨质疏松小鼠模型，通过微CT（μCT）分析骨微结构参数，采用组织化学染色（HE、ALP、免疫组化）评估骨形成状态。体外实验使用小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1和原代颅骨成骨细胞，通过ALP染色、茜素红染色、ATP检测、游离脂肪酸（FFA）含量测定等方法评估成骨分化能力和代谢状态。采用Mitotracker、JC-1、MitoSOX等荧光探针检测线粒体形态、膜电位（MMP）和活性氧（ROS）水平。通过线粒体提取、siRNA敲降（Drp1、Fis1）和过表达质粒（Mfn1、Opa1、Cpt2）等技术进行功能挽救实验。

结果

Pg EVs和Pe EVs可转运至小鼠骨髓腔并被成骨细胞内化

电镜观察显示Pg和Pe均能产生直径约180-200 nm的球形EVs。质谱分析发现Pg EVs特异性携带牙龈蛋白酶RgpA和RgpB。体内实验证实DiR标记的EVs在腹腔注射1小时后即可进入骨髓腔，3小时后积累增强。细胞实验表明EVs通过网格蛋白和脂筏介导的内存途径进入成骨细胞。

Pg EVs和Pe EVs抑制成骨细胞分化并加剧骨质疏松

微CT分析显示OVX小鼠经EVs处理后，骨小梁密度、骨体积分数（BV/TV）、骨表面积分数（BS/TV）和骨小梁数量（Tb.N）进一步降低。组织染色显示成骨标志蛋白胶原蛋白I（Col-1）和骨桥蛋白（OPN）表达下降，ALP活性减弱。体外实验表明EVs以剂量依赖方式抑制ALP活性和矿化结节形成，并下调成骨相关基因（Runx2、OSX、OCN、BSP、ALP、OPN）的mRNA表达。

Pg EVs和Pe EVs通过损害线粒体活性抑制成骨细胞分化

EVs处理导致成骨细胞线粒体ROS显著增加，膜电位降低，线粒体流量减少。透射电镜观察到线粒体肿胀、嵴减少和碎片化现象。添加外源性线粒体可部分逆转EVs引起的线粒体ROS升高、膜电位下降和ALP活性抑制，并恢复RUNX2和OSX蛋白表达。

Pg EVs和Pe EVs破坏成骨细胞线粒体动力学

EVs促进线粒体分裂蛋白Drp1、Fis1和Mff的表达，抑制融合蛋白Mfn1、Mfn2和Opa1的表达，导致线粒体网络断裂、分支长度和足迹面积减少。同时EVs上调线粒体自噬标志蛋白Pink1和Parkin的表达。体内实验进一步证实EVs处理组小鼠股骨组织中Drp1和Fis1表达升高，Mfn1和Opa1表达降低。

Pg EVs和Pe EVs通过抑制Cpt2表达和FFA氧化损害线粒体功能

EVs降低成骨细胞内ATP产量和FFA水平，抑制FAO活性。线粒体形态观察显示EVs处理导致线粒体长度缩短和脂滴（LDs）积累增加。WB分析表明EVs显著降低Cpt2蛋白水平，但不影响Cpt1表达。同时EVs抑制FAO限速酶（Hadha、Acot13、Echs1）的mRNA表达。动物实验显示EVs处理组小鼠血清ATP和FFA水平进一步降低，骨组织中Cpt2表达下降。

调控线粒体动力学可逆转EVs对Cpt2和FFA氧化的抑制

过表达Mfn1和Opa1或敲降Drp1和Fis1可恢复线粒体形态，增加线粒体长度和足迹面积，降低线粒体ROS水平，提高膜电位，并部分逆转EVs对Cpt2表达的抑制。同时，这些干预措施恢复FAO限速酶表达，提高细胞内FFA水平和ATP产量，最终改善成骨分化能力。

Cpt2过表达缓解EVs对成骨分化的抑制

在体外和体内过表达Cpt2可部分恢复FFA水平、FAO活性和ATP产量，减轻EVs对ALP活性和矿化结节形成的抑制，并提高成骨标志蛋白表达。值得注意的是，Cpt2过表达并未逆转EVs对线粒体融合/分裂蛋白表达的影响，表明Cpt2位于线粒体动力学下游。

讨论

本研究首次揭示Pg EVs通过血液循环迁移至骨髓腔，直接作用于成骨细胞，通过破坏线粒体动力学平衡（促进分裂/抑制融合）导致线粒体碎片化和功能损伤，进而下调Cpt2表达，抑制FAO代谢过程，最终阻碍成骨细胞分化和骨形成。与毒力较低的Pe EVs相比，Pg EVs表现出更强的致病性，可能与其特有的牙龈蛋白酶成分有关。研究不仅阐明了牙周病与系统性骨质疏松的关联机制，也为针对线粒体代谢的骨质疏松治疗提供了新靶点。

结论

Pg和Pe来源的EVs通过系统循环到达骨髓腔，被成骨细胞内化后破坏线粒体动力学平衡，抑制Cpt2介导的脂肪酸氧化代谢，最终导致成骨分化受阻和骨质疏松加剧。该研究为理解牙周病与系统性疾病关联提供了新的实验证据，突出了EVs在牙周病与系统性疾病关联中的关键作用。