犬醛酮还原酶1C3（AKR1C3/PGFS）的17β/20α-羟类固醇脱氢酶活性及其被曲洛斯坦抑制的特性研究

本研究针对犬类作为人类生物医学研究重要临床前模型，但其AKR1C亚家族仅存在单一基因（AKR1C3）的特性，系统表征了犬AKR1C3（d1C3）的酶学功能。研究人员发现d1C3具有NADPH依赖的17β/20α-羟类固醇脱氢酶活性，可催化雄激素、雌激素及神经甾体的代谢，并能高效还原异喹啉等内源性羰基化合物。尤为重要的是，研究首次揭示d1C3是治疗犬库欣病的药物曲洛斯坦的新靶点（IC50 0.30 μM），其抑制作用在正逆反应中分别呈现反竞争性和竞争性模式。该成果为理解犬类固醇激素代谢机制及曲洛斯坦的药理作用提供了新视角。

　　

在生物医学研究领域，犬类因其与人类在生理和疾病方面的相似性，成为不可或缺的临床前模型。然而，在关键的甾体激素代谢方面，犬类却展现出独特的生物学特征。与人类和其他哺乳动物拥有多个醛酮还原酶1C（AKR1C）亚家族成员不同，犬基因组中仅存在一个AKR1C基因，即AKR1C3。该基因编码的蛋白已知具有前列腺素F合成酶（PGFS）活性，但其在甾体激素代谢中的具体功能、底物特异性以及药理调控机制，长期以来却是一片模糊。厘清犬AKR1C3的生化特性，不仅对犬类比较生理学和内分泌学研究至关重要，也直接关系到将犬类模型用于人类激素依赖性癌症等疾病研究成果向临床的准确转化。

为了填补这一知识空白，来自日本岐阜大学药物发现与医学信息科学联合研究生院的研究团队，在《The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology》上发表了一项深入研究。他们旨在系统阐明犬AKR1C3（研究中简称为d1C3）的酶学性质，包括其底物特异性、催化特性、关键功能残基以及抑制剂敏感性，以期全面评估其在犬甾体激素代谢和药物作用中的潜在角色。

研究人员主要运用了重组蛋白表达与纯化、酶动力学分析、产物鉴定、定点突变以及抑制剂敏感性测试等关键技术方法。研究中使用的犬AKR1C3 cDNA由商业公司合成，并通过分子克隆技术构建于pET28a表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达，随后通过镍亲和层析进行纯化，获得高纯度的重组酶蛋白。酶活性通过监测NAD(P)H在340 nm吸光度或455 nm荧光强度的变化来测定。甾体反应产物通过薄层色谱或气相色谱/质谱联用进行鉴定。通过比较野生型酶与定点突变体（M55L）的动力学参数，探究了关键氨基酸残基的功能。

研究结果揭示了犬AKR1C3的多方面特性：

3.1. 对甾体的底物特异性

研究发现，d1C3利用NADPH作为辅酶，能够还原17-酮-C₁₉-甾体（如雄酮、表雄酮、脱氢表雄酮DHEA及其硫酸盐）、17-酮-C₁₈-甾体（如雌酮、其硫酸盐以及16-酮雌酮）和3,17-二酮-C₁₉-甾体（如5α-雄烷-3,17-二酮、雄烯二酮A4等），产物分析证实其为17β-羟类固醇脱氢酶（17β-HSD），催化生成相应的17β-羟基代谢物。值得注意的是，16-酮雌酮是d1C3最优秀的甾体底物，其催化效率（k_cat/K_m）高达82,100 min^-1mM^-1。同时，d1C3还对20-酮-C₂₁-甾体（如孕酮、脱氧皮质酮DOC、5α-二氢脱氧皮质酮DHDOC和5α-四氢脱氧皮质酮THDOC）表现出还原活性，产物为其20α-羟基衍生物，表明它同时具有20α-羟类固醇脱氢酶（20α-HSD）活性。然而，d1C3完全不具有3-酮甾体还原酶活性，这是其与人类AKR1C3的一个关键区别。在氧化反应中，d1C3对17β-和20α-羟甾体的活性远低于还原反应，说明它主要作为一种还原性的17β/20α-HSD发挥作用。

3.2. 在甾体代谢中的作用

基于底物特异性，研究推断d1C3可能参与犬体内多条甾体代谢途径。在雄激素和雌激素合成方面，d1C3可能催化从A4和5α-雄烷-3,17-二酮分别合成睾酮和5α-二氢睾酮（DHT），以及从雌酮合成17β-雌二醇。此外，它还可能参与11-氧代雄激素（如11-酮-睾酮）的生成。在孕激素、盐皮质激素和神经甾体代谢方面，d1C3通过将孕酮、DOC及其还原产物（5α-DHDOC, 5α-THDOC）转化为相应的20α-羟基代谢物，从而使其失活。这表明d1C3可能在犬妊娠维持、矿物质平衡和神经调节中发挥作用。关于3-酮甾体代谢，研究推测犬体内的这一功能可能由其他酶（如 carbonyl reductase 1, CBR1）承担。

3.3. 对非甾体羰基化合物和醇的底物特异性

d1C3还能还原多种非甾体羰基化合物，包括芳香醛、某些脂肪醛（如4-氧代-2-壬烯醛、全反式视黄醛）、芳香酮、对醌以及α-二羰基化合物。其中，异喹啉（isatin）是d1C3最优秀的底物，催化效率极高。然而，d1C3不还原PGD₂和PGE₂，这与一些其他物种的AKR1C酶不同。在氧化方向，d1C3仅对S-1-四氢萘醇等少数非甾体醇有微弱活性。

3.5. 序列比对与定点突变

序列比对发现，d1C3与人类AKR1C3在14个甾体结合残基中有6个不同。同源建模显示，d1C3中第55位的甲硫氨酸（M55）在人类AKR1C3中对应的是亮氨酸（L54）。为了探究M55的功能，研究人员构建了d1C3的M55L突变体。该突变使d1C3获得了原本不具备的PGD₂还原酶活性（尽管活性较低），并且出现了对5α-和5β-DHT的还原活性（分别表现为3β-HSD和3α-HSD活性），但对17/20-酮甾体的催化效率影响不大。这表明M55残基是决定d1C3缺乏3-酮甾体还原酶活性和PGD₂还原活性的关键因素，也提示猫科动物（其AKR1C3在55位为亮氨酸）的AKR1C3可能具有更广泛的底物特异性。

3.6. 抑制剂敏感性

抑制剂筛选发现，d1C3可被类黄酮、非甾体抗炎药、胆汁酸、苯溴马隆、阿比特龙和曲洛斯坦等多种化合物抑制。其中，胆汁酸（如石胆酸）和用于治疗犬库欣病的药物曲洛斯坦抑制作用最强。曲洛斯坦对d1C3的IC₅₀值为0.30 μM。动力学分析表明，在NADPH依赖的异喹啉还原反应（正向反应）中，曲洛斯坦和石胆酸的抑制类型为反竞争性；而在NADP⁺依赖的S-1-四氢萘醇氧化反应（逆向反应）中，抑制类型为竞争性。M55L突变对部分抑制剂（如氟芬那酸、花生四烯酸等）的敏感性有轻微影响。

综上所述，本研究首次全面揭示了犬AKR1C3作为一种独特的17β/20α-羟类固醇脱氢酶的生化特性。它不仅参与犬体内活性雄激素、雌激素的合成以及孕激素、盐皮质激素和神经甾体的灭活，还代谢异喹啉等内源性羰基化合物。研究明确了M55残基对其底物选择性的关键作用，并首次发现d1C3是治疗犬库欣病的药物曲洛斯坦的高亲和力新靶点。这些发现深化了对犬类甾体激素代谢网络的理解，为利用犬模型进行转化医学研究提供了重要的酶学基础，同时也为曲洛斯坦在犬科动物疾病治疗中的药理作用和潜在新适应症（如激素依赖性癌症、神经系统疾病）的探索开辟了新路径。