靶向线粒体聚合物cLipG/CuET通过激活cGAS/STING通路增强胆管癌免疫治疗

本研究针对细胞外基质重塑导致化疗药物治疗肝内胆管癌(ICC)疗效不佳的问题，设计了一种基于甘草酸(GA)和二乙基二硫代氨基甲酸铜(CuET)的纳米复合物cLipG/CuET。该复合物通过GA打开线粒体通透性转换孔(MPTP)，促进Cu(II)通过铜毒性破坏线粒体功能，激活巨噬细胞中的cGAS-STING信号通路，显著增强线粒体活性氧(mtROS)产生，并促进受损线粒体DNA(mtDNA)从ICC细胞中逃逸，从而增强M1极化癌症相关巨噬细胞的免疫反应。在小鼠模型中，cLipG/CuET静脉给药将ICC从“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤，与免疫检查点抑制剂aCTLA-4协同作用，为ICC患者提供了新的治疗策略。

　　

肝内胆管癌(Intrahepatic Cholangiocarcinoma, ICC)是一种罕见但高度侵袭性的恶性肿瘤，其发病率逐年上升，预后极差。ICC的结构特点包括丰富的细胞外基质和肿瘤微环境中的非免疫细胞（如癌症相关成纤维细胞和肿瘤相关巨噬细胞），这些结构限制了治疗药物充分发挥疗效。研究表明，ICC组织中CTLA-4阳性淋巴细胞比癌旁肝组织更丰富，PD-1/PD-L1和CTLA-4信号的激活与ICC不良预后相关，提示靶向CTLA-4的药物具有治疗潜力。目前，手术切除是早期ICC的主要治疗方法，而吉西他滨联合顺铂用于不可切除或转移性ICC。其他策略如局部治疗、靶向治疗和免疫治疗也显示出各自的优缺点，但仍需开发更有效的治疗手段来改善ICC患者的预后。

近年来，研究发现cGAS/STING（环鸟苷酸-腺苷酸合成酶/干扰素基因刺激因子）通路在触发先天免疫反应中发挥关键作用，能够增强免疫治疗效果。当线粒体DNA(mtDNA)或基因组DNA从肿瘤细胞中泄漏到细胞质时，可以激活抗原呈递细胞中的cGAS/STING信号通路，从而增强宿主的免疫反应。铜死亡(Cuproptosis)是一种新发现的调节性细胞死亡形式，与铜诱导的线粒体功能障碍独特相关。细胞内铜的积累会引起线粒体脂酰化蛋白的聚集和Fe-S簇蛋白的不稳定，为设计靶向线粒体的ICC治疗提供了新线索。然而，铜离子的抗癌特性依赖于铜稳态的维持以及与其他蛋白质的相互作用。例如，铜伴侣蛋白CCS（Copper Chaperone for Superoxide Dismutase）可以通过直接与超氧化物歧化酶1(SOD1)相互作用将铜离子转移至酶中，SOD1在维持细胞内活性氧(ROS)稳态中起关键作用。但铜离子难以被引入线粒体，因此需要设计精确的药物递送系统。

线粒体通透性转换孔(MPTP)是线粒体内膜中的一个重要通道，在高基质Ca²⁺和氧化应激条件下打开。频繁和持续的MPTP开放可以增加ROS产生、电子泄漏，并降低线粒体膜电位(MMP)，从而促进细胞凋亡。18β-甘草次酸(GA)是从中药甘草中提取的活性成分，可以通过打开MPTP引起线粒体损伤。GA通过与电子传递链中线粒体复合物I的Fe-S簇相互作用诱导氧化应激，产生过氧化氢(H₂O₂)，随后氧化关键的硫醇基团和内源性吡啶核苷酸，这些氧化修饰最终触发MPTP的开放。因此，研究人员提出GA与其他药物联合可以增强药物递送效率。

在这项发表于《Journal of Nanobiotechnology》的研究中，Bai等人设计并合成了一种新型药物递送系统，利用磷脂作为纳米载体激活癌细胞内的cGAS/STING信号通路。首先，通过(4-羧丁基)三苯基溴化磷(CTPP)与十八胺(ODA)在催化剂作用下合成了一种疏水亲脂化合物CTPP-ODA。CTPP作为一种具有足够亲脂性和离域正电荷的阳离子，可以通过减少从水环境转移到疏水环境所需的自由能变化，有效在线粒体中积累，从而提高跨膜运输和靶向膜电位高的肿瘤细胞的效率。随后，用CTPP-ODA修饰脂质体并封装GA，进一步用二硫化四乙基秋兰姆铜(CuET)修饰形成纳米颗粒cLipG/CuET。CuET是药物双硫仑(DSF)与铜形成的复合物，但由于其溶解性差和渗透性有限，研究人员将GA封装到cLipo中最终合成了cLipG/CuET纳米颗粒。

为开展研究，作者团队运用了以下关键技术方法：1）纳米脂质体合成与表征，包括动态光散射(DLS)和透射电镜(TEM)分析粒径与形貌；2）细胞与线粒体摄取实验，使用荧光探针Coumarin 6和流式细胞术验证靶向效率；3）体外药效评估，通过CCK-8、凋亡检测和克隆形成实验分析抗肿瘤效果；4）分子机制研究，采用Western blotting、qPCR和免疫荧光检测cGAS/STING通路关键蛋白及mtDNA释放；5）体内实验，利用KRAS^G12D/P19质粒诱导的小鼠原位胆管癌模型评估生物分布和治疗效果，并结合免疫检查点抑制剂aCTLA-4分析协同效应。

研究结果如下：

Preparation and characterization of cLipG/CuET

通过合成CTPP-ODA并修饰脂质体，成功制备了cLipG/CuET纳米复合物。透射电镜显示脂质体呈均匀球形，动态光散射测定其平均直径为123.05 nm，Zeta电位为-8.12 mV。药物释放实验表明，cLipG/CuET在中性pH下具有缓释特性，延长了循环时间。

Cellular uptake and mitochondria-targeting effect of cLipG

使用Coumarin 6标记的cLipG/C6处理HuCCT1细胞，荧光显微镜和流式细胞术显示cLipG/C6具有最强的细胞摄取和线粒体靶向效率。线粒体分离和Western blot验证了TOM20标记的线粒体富集，Cu²⁺浓度测量证实cLipG/CuET显著增加线粒体内铜积累。

Cytotoxicity and cell apoptosis analysis of cLipG/CuET

CCK-8实验显示cLipG/CuET对HuCCT1细胞具有显著细胞毒性，ZIP模型分析表明cLipG与cLipo/CuET联合具有相加效应。Annexin V/PI染色和流式细胞术证实cLipG/CuET促进细胞凋亡，克隆形成实验显示其抑制细胞增殖，Western blot检测到凋亡相关蛋白Caspase 3激活和BCL2下调。

cLipG/CuET mediated opening of the MPTP

Calcein-AM染色实验证明cLipG/CuET处理导致荧光淬灭，表明MPTP开放。Western blot显示铜死亡相关蛋白FDX1、LIAS和DLAT下调，透射电镜观察到线粒体萎缩和嵴消失，ATP水平下降，JC-1染色证实线粒体膜电位丧失，DCFH-DA探针检测到ROS增加，细胞色素C从线粒体释放到胞质。

cLipG/CuET enhances the immune response in vitro

qPCR显示胞质mtDNA增加，免疫荧光显示TFAM与TOM20共定位减少，表明mtDNA释放。巨噬细胞THP-1与处理后的HuCCT1细胞上清共培养，Western blot检测到cGAS/STING通路关键蛋白p-STING、p-IRF3和p-TBK1磷酸化增强，ELISA检测到cGAMP释放，HMGB1水平升高。流式细胞术显示M1型巨噬细胞比例增加，M2型减少，表明TAMs向M1表型复极化。

In vivo distribution of cLipG

小鼠模型体内成像显示cLipG/IR780在肿瘤部位积累从1小时开始，8小时达到峰值，24小时仍保持滞留，离体器官荧光显示肝脏中信号最强，证实cLipG具有优异的肿瘤靶向能力。

Synergistic effects of cLipG/CuET and aCTLA-4 against ICC in vivo

小鼠体内治疗实验显示，cLipG/CuET与aCTLA-4联合治疗显著抑制肿瘤生长，降低肝脏重量，H&E和免疫组化染色显示肝组织保护更好，Ki67减少，TUNEL增加。流式细胞术显示CD8⁺ T细胞浸润增加，M1型巨噬细胞比例升高，M2型降低，免疫荧光证实M1标志物CD86增加，M2标志物CD206减少。此外，cDC细胞和TH1细胞比例增加，血清中IFN-β、IL-6和TNF-α水平升高，表明系统性抗肿瘤免疫增强。STING敲除小鼠实验进一步验证了cGAS/STING通路的关键作用。

研究结论表明，cLipG/CuET通过靶向线粒体诱导铜死亡和mtDNA释放，激活cGAS/STING通路，重塑肿瘤微环境，促进抗肿瘤免疫反应。与免疫检查点抑制剂aCTLA-4联合使用显示出协同效应，为肝内胆管癌的治疗提供了创新策略。该研究不仅揭示了铜死亡和线粒体靶向在癌症免疫治疗中的潜力，还为开发基于纳米技术的联合疗法奠定了坚实基础。