一氧化氮释放型光热纳米酶涂层用于加速感染性糖尿病伤口愈合的协同治疗策略

本研究针对耐药细菌生物膜导致的糖尿病伤口难以愈合问题，开发了近红外响应的NO释放Ce:Zn纳米花(PDA@SNP@Ce:Zn NFs)。该系统通过金属离子、光热效应和一氧化氮(NO)的协同作用，有效清除MRSA和SA生物膜，抑制毒力因子表达，并显著促进糖尿病大鼠感染伤口的血管生成和愈合过程。

　　

糖尿病伤口愈合一直是全球性的临床挑战，特别是感染性糖尿病伤口更容易形成细菌生物膜，由于抗生素难以穿透生物膜基质且耐药菌问题日益严重，传统治疗方法效果有限。高血糖状态导致血管功能障碍、内皮细胞功能异常、活性氧(ROS)水平升高，进一步阻碍血管生成和组织再生。耐甲氧素金黄色葡萄球菌(MRSA)和金黄色葡萄球菌(SA)形成的生物膜及其分泌的酚溶性调节蛋白(PSMs)和葡萄球菌黄质(staphyloxanthin)等毒力因子，更是让伤口雪上加霜。

面对这一难题，研究人员在《Journal of Nanobiotechnology》上发表了一项创新研究，开发了一种集光热治疗(PTT)、一氧化氮(NO)释放和金属离子抗菌于一体的多功能纳米花系统。这种名为PDA@SNP@Ce:Zn NFs的纳米材料，通过水热法合成二氧化铈-氧化锌纳米花，表面包覆聚多巴胺(PDA)增强光热转换能力，并负载硝普钠(SNP)作为NO供体，为糖尿病感染伤口提供了全新的解决方案。

研究采用的主要技术方法包括：水热法制备Ce:Zn纳米花，表面聚多巴胺包覆和SNP负载；体外光热效应和NO释放动力学测定；纳米酶催化活性(氧化酶和过氧化物酶样活性)评估；通过最小抑菌浓度(MIC)、活死染色、扫描电镜(SEM)和蛋白泄漏实验分析抗菌和抗生物膜效果；使用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验评估血管生成能力；最后在MRSA感染的糖尿病大鼠模型中进行体内伤口愈合评价。

Synthesis and characterization of nanoflowers

研究人员通过水热法成功合成了花状结构的Ce:Zn纳米花，扫描电镜显示其具有均匀排列的尖锐花瓣结构，平均花瓣尺寸为456.45±6.58 nm。XPS分析证实了Ce、Zn、O等元素的存在，Zn2p峰位于1020.6 eV和1043.8 eV，表明Zn处于+2价态。PDA包覆后，纳米花表面呈现颗粒状结构，FTIR光谱中出现了1288 cm^-1(C-O)、1492 cm^-1(C=N/C=O)和1607 cm^-1(O-H/N-H)等特征峰，证实了PDA的成功包覆。

Evaluation of in vitro photothermal effect and NO release kinetics

PDA@SNP@Ce:Zn NFs表现出优异的光热转换性能，在808 nm激光照射(1 W/cm²)5分钟后，温度升至49.3℃。NO释放研究表明，在激光照射下48小时内NO释放量达96.37%，而无激光组仅释放15.32%。释放动力学符合一级反应模型，表明光热效应能有效触发NO释放。

Catalytic activity and in vitro cell studies

纳米花表现出类过氧化物酶(POD)和类氧化酶活性，能够催化TMB底物氧化。Michaelis-Menten动力学分析显示，Ce:Zn NFs具有最高的催化效率(K_m=0.376 mM，V_max=3.561 μM/min)。细胞实验表明，纳米花在低浓度下无细胞毒性，划痕实验显示PDA@SNP@Ce:Zn NFs(+L)处理组在12小时后伤口闭合率达98.97±2.13%。

Chorioallantoic membrane(CAM) assay

CAM实验显示，PDA@SNP@Ce:Zn NFs(+L)处理组在8小时后显著促进新血管形成，表明其具有良好的血管生成潜力，这主要归因于NO的释放促进血管内皮细胞迁移。

Determination of MIC and live-dead analysis

抗菌实验显示，PDA@SNP@Ce:Zn NFs对MRSA和SA的MIC值分别为32μg/mL和32μg/mL。活死染色和流式细胞术证实，激光照射组细菌死亡率显著提高，红色荧光(死菌)强度明显增加。

Interaction of nanoflowers with bacteria and protein leakage

SEM观察发现，纳米花与细菌膜相互作用导致膜结构损伤，激光照射后细菌形态严重破坏。Bradford试剂检测显示，PDA@SNP@Ce:Zn NFs(+L)处理组蛋白泄漏最显著，表明细菌膜通透性增加。

Inhibition of spreading motility

纳米花处理显著抑制了MRSA和SA的扩散运动能力，表明其能够抑制Agr群体感应系统调节的PSMs介导的细菌扩散。

Biofilm inhibition by crystal violet and congo red assay

结晶紫和刚果红实验表明，PDA@SNP@Ce:Zn NFs(+L)对MRSA和SA生物膜的抑制率分别达87.7±6.32%和89.4±7.3%。激光照射显著增强了对生物膜的清除效果。

Biofilm live/dead staining and EPS eradication

生物膜活死染色显示，激光照射组生物膜中死菌比例显著增加。EPS分泌实验表明，纳米花处理显著减少了胞外多糖的产生。

In vivo wound healing effect

体内实验表明，PDA@SNP@Ce:Zn NFs(+L)处理组在第11天伤口闭合率达87.21%，第14天完全愈合。组织匀浆菌落计数显示，治疗组细菌数量显著减少。免疫组化显示CD44(血管生成标记)表达上调，TNF-α(炎症标记)表达下调。Masson三色染色显示治疗组胶原沉积更加丰富有序。

研究结论表明，这种多功能纳米花系统通过光热效应、NO释放和金属离子的协同作用，有效破坏了细菌生物膜结构，抑制了毒力因子表达，并通过促进血管生成和胶原沉积加速了糖尿病感染伤口的愈合过程。该研究为耐药细菌感染的治疗提供了新思路，特别是通过物理机制(光热效应)和化学机制(NO释放、金属离子)的结合，减少了细菌耐药性发展的风险。然而，研究也指出未来需要探索该系统对多微生物生物膜的效果，并进行长期安全性评估。

这项工作由印度海得拉巴Birla Institute of Technology & Science的研究团队完成，得到了印度医学研究委员会(ICMR)的支持，为纳米材料在感染性伤口治疗中的应用提供了重要参考。