ProPE技术拓展基因编辑窗口：提升低效位点编辑效率并推动疾病建模与治疗应用

《Nature Catalysis》：ProPE expands the prime editing window and enhances gene editing efficiency where prime editing is inefficient

本研究针对Prime Editing（PE）技术存在的编辑效率低、优化过程复杂等瓶颈问题，开发了一种新型基因编辑工具——延长编辑窗口的Prime Editing（proPE）。该系统通过引入第二个非切割性sgRNA（tpgRNA）将逆转录模板靶向编辑位点附近，有效克服了PE的五大技术限制，将低效编辑（PE效率<5%）的整体效率提升6.2倍至29.3%，显著扩展了PE在人类致病性单核苷酸多态性（SNP）矫正中的应用范围。该研究为疾病模型构建和基因治疗提供了更高效的解决方案。

　　

基因编辑领域近年来迎来重大突破，Prime Editing（PE）技术因其能够实现精确的基因组修改而备受关注。与传统CRISPR-Cas9系统不同，PE不需要产生DNA双链断裂，也无需供体DNA模板，从而显著减少了不必要的基因修饰。然而，PE技术在实际应用中面临严峻挑战——编辑效率不稳定且需要大量优化工作，特别是在prime editing guide RNA（pegRNA）的3'延伸区域设计上尤为复杂。

这项由Sarah Laura Krausz等研究人员在《Nature Catalysis》发表的研究，针对PE技术的核心瓶颈开发了创新解决方案。PE系统通过将逆转录酶与Cas9切口酶融合，利用延伸的sgRNA携带包含目标DNA修饰的逆转录模板来完成编辑。整个过程包含五个关键步骤：编辑器复合物结合DNA并切割非靶链、释放的3'DNA末端与pegRNA的引物结合位点（PBS）杂交、逆转录酶沿pegRNA的逆转录模板（RTT）延伸非靶链、含编辑的DNA链形成3' flap并与原始DNA的5' flap平衡、最终通过内源性瓣状核酸内切酶切割和连接完成编辑。

然而，这个精密过程存在多个效率限制点。研究人员通过系统分析发现，PE在编辑位点远离切口位置时效率显著下降，这严重限制了其在人类致病性SNP矫正中的应用价值——超过半数的致病SNP位于PE有效编辑窗口之外。

为解决这一难题，研究团队开发了proPE（prime editing with prolonged editing window）系统。该系统的创新之处在于使用两种独立的sgRNA：必需切口引导RNA（engRNA）和模板提供引导RNA（tpgRNA）。engRNA是常规sgRNA，用于引导prime editor蛋白在DNA上产生切口；tpgRNA则携带PBS和RTT序列，通过截短的空间序列（11-15个核苷酸）使SpCas9失活，从而避免DNA切割但保留靶标结合能力。

研究团队通过质粒基础的PE活性报告系统（PEAR）和人类细胞系的扩增子深度测序，系统评估了proPE的性能。结果显示，proPE通过五种独特机制有效克服了PE的效率限制：消除pegRNA内PBS-间隔区相互作用、提高动态交换效率、促进截短flap重新延伸、减少重新结合和重新切口事件。

在技术方法方面，研究团队构建了多种prime editor表达质粒（包括PE2、PE3、PE5、PEmax等变体），设计了特异性sgRNA表达系统，建立了PEAR报告基因检测体系，并运用流式细胞术和下一代测序技术对编辑效率进行定量分析。实验涉及HEK293T、U2OS、K562以及人类胚胎干细胞（HuES）等多种细胞系，通过并行转染比较不同参数条件下的编辑效果。

proPE显著提升靶向远端编辑效率

研究人员首先通过概念验证实验证实，proPE编辑需要tpgRNA和engRNA同时存在。值得注意的是，当编辑位点位于靶标远端时（距离>10个核苷酸），PE效率急剧下降至9%，而proPE则保持稳定表现。通过设计三组不同距离的编辑实验（靶标内编辑、靶标近端编辑和靶标远端编辑），发现proPE对编辑位点与切口距离的敏感性显著低于PE，在靶标远端编辑中实现中位数6.9倍的效率提升。

降解tpgRNA的抑制作用弱于降解pegRNA

当研究人员考察tpgRNA间隔区长度对proPE活性的影响时，发现10-15个核苷酸的间隔区长度可实现有效编辑。更重要的是，降解的tpgRNA对proPE的抑制作用显著低于降解的pegRNA对传统PE的影响。这归因于截短间隔区使SpCas9失活，形成非活性复合物具有更短的停留时间，从而促进更高效的逆转录重新启动。

engRNA水平优化增强编辑特异性

研究表明，通过精细调整engRNA用量可显著改善编辑效率。当增加tpgRNA量时编辑达到饱和，而增加engRNA量则呈现先升后降的趋势，表明PE效率低下可能是由于切口活性不足或过度所致。proPE允许独立调整切口活性而不改变RTT-PBS模板量，这一特性在处理高indel背景或靶标外编辑时尤为有利。

proPE对低效编辑的提升最为显著

在15个靶标远端位置的新编辑测试中，proPE将中位编辑效率从1.4%提升至5.5%，特异性提高1.5倍。特别值得注意的是，对于PE效率低于5%的编辑位点（中位值0.7%），proPE将效率提升至最高14.9%，中位提升倍数达6.5，特异性提升7.3倍。这一提升在多种难编辑细胞系（包括U2OS、K562和HuES细胞）中均得到验证。

扩展人类致病性SNP的编辑范围

通过对细胞色素P450（CYP）基因家族自然变异的研究，团队测试了62种不同的PE组合。结果显示，53种组合的PE效率未达到5%，而proPE在这些组合中均表现更优，编辑效率中位提升5.13倍，特异性提升3.46倍。这表明proPE能够有效覆盖传统PE难以企及的临床相关突变位点。

提升等位基因特异性编辑能力

proPE的双靶点设计要求使其在等位基因特异性编辑方面展现独特优势。在以CYP1A1和CYP1A2基因为模型的实验中，proPE成功实现了传统PE无法完成的基因特异性编辑，特异性提升最高达9.7倍。同时，由于需要两个靶点同时存在，proPE显著降低了脱靶编辑风险。

研究团队还证实proPE与腺相关病毒（AAV）递送系统兼容，并开发了在线设计工具proPE planner，便于研究人员选择和设计engRNA-tpgRNA组合。

该研究的结论部分强调，proPE通过扩展有效编辑距离和提升低效位点的编辑效率，使大多数致病性SNP的疾病模型构建变得可行。特别在干细胞编辑方面，proPE对低效编辑的大幅提升可能极大促进诱导多能干细胞单克隆的生成。这些突破性进展不仅扩展了PE技术在基础研究中的应用范围，也为未来基因治疗策略的发展提供了重要技术支撑。

研究数据表明，proPE能够将编辑效率提升至临界水平（>5%）以上，这使得针对大多数致病SNP的疾病模型构建变得实际可行。同时，该技术显著增强了PE在治疗干预中的应用潜力，特别是在需要高精度和特异性的临床场景中展现出独特价值。