通过光疗增强的混合疫苗，促进肿瘤抗原的直接呈递以激活抗肿瘤免疫

《Materials Today》：Facilitating direct presentation of tumor antigens to activate anti-tumor immunity by phototherapy-potentiated hybrid vaccine

肿瘤疫苗通过光热-光动力治疗剂BTS-2F诱导免疫原性细胞死亡，释放抗原激活树突状细胞，协同PD-1阻断增强T细胞记忆应答，实现抗肿瘤免疫。

　　肿瘤疫苗作为一种免疫治疗手段，近年来在肿瘤治疗领域展现出巨大的潜力。然而，实体肿瘤内部的免疫抑制微环境极大地阻碍了这些疫苗在诱导长期免疫反应方面的效果，突显了开发新型策略以革新疫苗治疗方式的必要性。本文提出了一种双策略，结合供体基团和氟化工程，开发出一种具有聚集诱导发射特性的光疗剂（BTS-2F）。这种纳米颗粒（BNP）在660纳米激光照射下，通过高效的系间窜越过程，能够高效产生活性氧（ROS）并实现光热转换，从而在光动力疗法和光热疗法中有效杀灭4T1乳腺癌细胞和大肠杆菌，提高肿瘤抗原的可利用性，进而形成一种混合疫苗（BNP@HV）。该混合疫苗中的细菌成分不仅作为强效的免疫诱导剂和佐剂，还能在皮下注射后进入淋巴结，促进肿瘤抗原的交叉呈递，并激活STING通路以激活树突状细胞（DCs）。因此，强大的T细胞反应能够诱导抗肿瘤免疫，并建立持久的抗肿瘤记忆。此外，BNP@HV还能增强PD-1检查点阻断疗法的效果，激活小鼠的适应性免疫系统，从而抑制肿瘤生长。这项研究为设计预防性和治疗性肿瘤疫苗提供了新的范式，有望提升临床疗效。

在癌症治疗领域，免疫疗法正成为一种新兴的治疗策略，其通过激活宿主的免疫系统，引发抗肿瘤免疫反应，从而消除实体肿瘤并为癌症治愈带来希望。近年来，临床癌症免疫疗法取得了多项重大突破，包括肿瘤疫苗、嵌合抗原受体修饰T细胞（CAR-T）以及免疫检查点阻断（ICB）等技术。然而，免疫抑制微环境和患者之间的个体差异，仍然限制了免疫疗法的疗效。例如，最显著的ICB疗法——阻断程序性死亡1（PD-1）/程序性死亡配体1（PD-L1）的相互作用，对于某些患者的效果有限，原因在于缺乏可靠的生物标志物进行患者分类，以及免疫抑制“冷”肿瘤微环境（TME）的影响，导致治疗响应率仅为20%-40%。这一现象凸显了探索协同组合策略以优化治疗效果的重要性。

全肿瘤衍生疫苗（TDV）是一种通过释放肿瘤碎片中的内源性肿瘤抗原，从而引发全身性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应的策略，旨在消灭原发肿瘤以及远处或转移性肿瘤。在多种TDV制备方法中，诱导免疫源性肿瘤细胞死亡（ICD）是一种有效的策略，可以促进肿瘤细胞释放免疫刺激性内容物。这一过程有助于抗原的交叉呈递，从而逆转肿瘤的免疫抑制微环境，增强免疫治疗的效果。近年来，光疗技术，包括光动力疗法（PDT）和光热疗法（PTT），已被广泛研究用于诱导强大的ICD，从而有效引发抗肿瘤免疫反应。然而，目前可使用的光敏剂和光热剂，如贯叶金丝草素（hypericin）、吲哚菁绿（ICG）和氯乙酰苯肼（Ce6）等，由于其自身难以生成足够的损伤相关分子模式（DAMPs），因此在实现满意的肿瘤免疫治疗方面存在局限。此外，这些传统材料在生理环境中可能因聚集导致的荧光淬灭（ACQ）效应而影响治疗效果。大多数传统有机发光材料具有较大的π共轭系统，在聚集状态下（高浓度溶液或固态），通过分子间的π-π堆叠形成激基缔合物，导致非辐射能量耗散，从而减弱荧光甚至出现淬灭。因此，具有聚集诱导发射（AIE）特性的光疗剂的发展成为一种有前景的解决方案。AIE是一种独特的光物理现象，某些化合物在单体状态下发光较弱，但在聚集状态下则表现出显著增强的荧光。这种现象克服了传统荧光材料中的ACQ效应。AIE机制主要源于分子内运动的限制（RIM）。在聚集状态下，受限的分子运动抑制了非辐射衰变途径，从而促进辐射能量耗散，导致荧光显著增强。当这些AIE发光材料在聚集状态下表现出RIM时，其不仅具有增强的热转换能力，还能高效产生ROS，因此成为制备肿瘤疫苗的理想材料。相比传统的疫苗制备方法，如液氮冻融循环和化疗诱导刺激，AIE发光材料介导的光疗技术展现出更大的优势。它不仅能够更强烈地引发ICD，释放出更丰富的抗原，还能表现出较低的毒性和副作用。尽管如此，某些特定类型的肿瘤中的免疫抑制微环境仍然可能形成一个保护屏障，阻碍免疫效应细胞对肿瘤细胞的攻击。如何同时重塑免疫抑制微环境并确保抗肿瘤免疫反应，仍然是制备下一代肿瘤疫苗的一个引人注目却棘手的问题。

越来越多的证据表明，细菌在肿瘤定植过程中能够激活和调节抗肿瘤免疫。基于这一特性，研究者们已经取得了显著进展，将细菌重新定位为癌症免疫治疗的佐剂。例如，Arpaia等人设计了一种基于益生菌Nissle 1917的肿瘤特异性细菌疫苗。这些工程化的细菌能够表达独特的肿瘤抗原，并引发精确的免疫刺激，从而产生强效且持久的肿瘤特异性抗原免疫反应。此外，这种新型的微生物肿瘤抗原疫苗不仅在多种肿瘤模型和遗传背景中表现出抗肿瘤效果，还能广泛调控肿瘤微环境中的免疫景观。近期，一种天然的STING激活剂——2′3′-环磷酸鸟苷酸（2′3′-cGAMP）被封装在脂质体中，制成了仿生纳米颗粒PS-GAMP。该纳米颗粒能够激活肺泡上皮细胞中的STING信号通路，从而招募并分化CD11b+ DCs，并引发体液免疫反应。值得注意的是，研究表明，具有STING激活能力的环二核苷酸可以从细菌中提取，这使得它们成为增强细胞内免疫反应的理想病原体相关分子模式（PAMPs）。受到这些研究的启发，我们考虑利用死亡的细菌和肿瘤细胞共同形成一种混合疫苗，以实现对肿瘤的预防和治疗。

本文中，我们通过供体基团和氟化工程的双策略构建了AIE光疗剂BTS-2F，使其在聚集状态下表现出增强的ROS生成能力和光热转换能力。随后，BTS-2F纳米颗粒（BNP）在激光照射下被用于杀灭肿瘤细胞和大肠杆菌，再将两者混合，制备成一种混合疫苗（BNP@HV）。大肠杆菌释放的2′3′-cGAMP和PAMP作为有效的先天免疫细胞刺激物，激活STING通路并促进DCs的成熟。此外，BNP@HV在淋巴结迁移方面优于单纯的肿瘤衍生疫苗（BNP@TDV），从而促进肿瘤抗原的交叉呈递。结果表明，BNP@HV能够激活CD8+ T细胞，建立持久的抗肿瘤免疫记忆，从而有效应对肿瘤挑战。值得注意的是，BNP@HV还能增强PD-1检查点阻断疗法的效果，从而抑制肿瘤生长并延长小鼠在4T1乳腺癌模型中的生存时间。这项研究为肿瘤疫苗的设计提供了新的框架，能够有效触发抗肿瘤免疫反应，并为个性化免疫治疗和精准医学应用展现出广阔前景。

为了更深入地了解BTS-2F的光物理特性，我们将其与两种结构修饰的类似物进行了比较，根据之前的报告：TTS-2F在供体单元中增加了三苯胺旋转基团，而BTS-2Cl则在某些方面进行了调整。通过这些比较，我们进一步探讨了BTS-2F在不同条件下的性能表现。此外，我们还对BNP的制备和表征进行了详细研究，包括其在激光照射下的光热转换效率和ROS生成能力。这些实验结果表明，BNP在杀灭肿瘤细胞和细菌方面表现出显著优势，同时其在体内的分布和迁移能力也得到了验证。通过这些研究，我们进一步明确了BNP@HV在激活免疫系统和诱导抗肿瘤免疫记忆方面的潜力。

在实验设计和数据分析方面，X-J. L、B.Z.T.和T.Z.共同构思并设计了研究方案。M.S.、P.S.、Y.L.、K.W.和S.N.负责进行体外实验和体内实验。M.S.协助完成了化学合成工作，T.Z.进行了理论计算。T.Z.、X-J.L.和B.Z.T.分析了实验数据，并参与了讨论。T.Z.、X-J.L.和B.Z.T.构思并获得了本项目的资金支持。T.Z.、X-J.L.和B.Z.T.监督了整个研究过程。M.S.和T.Z.撰写了本文。所有作者都参与了讨论，并对研究的各个方面进行了深入思考。

在研究过程中，我们获得了多项资金支持，包括国家自然科学基金（项目编号：52303224、82303797和82473348）、广东省基础与应用基础研究基金（2024A1515010855）、广州医科大学博士后启动基金（项目编号：Q0301-126）、国家重点研发计划（项目编号：2021YFA1201000、2023YFC2605000）、国家自然科学基金重点项目（项目编号：82430067、32030060）等。这些资金支持为本研究的顺利进行提供了重要保障，使我们能够在肿瘤疫苗的设计和开发方面取得突破性进展。

此外，我们还特别关注了研究中的伦理和利益冲突问题。作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。这一声明确保了研究的客观性和公正性，使我们能够以科学的态度进行研究和发表。通过这些努力，我们不仅在技术上取得了进展，还在伦理和科学规范方面严格遵守，为未来的研究奠定了坚实的基础。

总的来说，本研究通过创新的双策略设计了一种具有聚集诱导发射特性的光疗剂BTS-2F，并将其应用于肿瘤细胞和细菌的联合杀灭，从而形成了一种混合疫苗BNP@HV。这种混合疫苗不仅能够有效激活先天免疫细胞和适应性免疫系统，还能通过STING通路促进树突状细胞的成熟，进而引发强大的T细胞反应。这些反应不仅能够有效清除肿瘤，还能建立持久的抗肿瘤记忆，为肿瘤的预防和治疗提供了新的思路。同时，BNP@HV还能够增强PD-1检查点阻断疗法的效果，使小鼠在4T1乳腺癌模型中表现出更好的治疗效果。因此，本研究不仅在技术上取得了突破，还在临床应用方面展现出广阔前景。通过这些研究，我们希望能够为未来的肿瘤疫苗设计提供新的范式，推动个性化免疫治疗和精准医学的发展。