基于蛋白质剪接的双AAV基因疗法在DFNB9耳聋小鼠模型中的优势研究

为解决DFNB9耳聋基因治疗中大基因递送效率低的问题，研究人员开展了RNA剪接与蛋白质剪接双AAV策略的比较研究。结果表明，基于蛋白质剪接的AAV1-intein系统在新生及成年Otof-/-小鼠中可实现长达12个月的听力恢复（35-70 dB），其突触功能重建效果显著优于RNA剪接策略，为大型基因治疗提供了新范式。

　　

由OTOF基因突变引起的DFNB9是一种常见的遗传性耳聋。虽然基于双AAV的基因替代疗法已被证明可以部分恢复DFNB9患者的听力，但治疗效果仍有待提高。一个关键的科学问题在于，如何更有效地在体内重建全长OTOF基因的功能。目前主流的策略依赖于双AAV载体在核酸水平的重组，例如通过RNA剪接机制。然而，这种方法的效率是否最优？是否存在其他更具优势的重组策略？这些问题促使研究人员去探索和比较不同的双AAV重组策略，以期优化DFNB9的基因治疗方案，并为其他大基因的递送提供参考。

为了回答这些问题，研究人员构建了五种基于不同重组原理的双AAV1治疗制剂。他们分别采用了基于RNA剪接的策略（包括AAV1-AK、AAV1-AP和AAV1-TS系统）和基于蛋白质剪接的策略（AAV1-intein系统），并在Otof^-/-耳聋小鼠模型中系统比较了它们的治疗效果。

本研究主要应用了以下关键技术方法：利用双AAV1载体系统构建基因治疗制剂；在Otof^-/-基因敲除小鼠模型（包括新生和成年小鼠）中进行耳蜗内注射；通过听觉脑干反应（ABR）检测评估听力功能恢复程度；采用免疫荧光染色和共聚焦显微镜成像观察耳蜗内耳蜗蛋白（otoferlin）的重新表达情况；对耳蜗带状突触（ribbon synapse）进行计数和功能分析以评估突触修复效果。

不同重组策略对听力恢复的影响

研究人员通过听觉功能测试发现，基于RNA剪接的AAV1-AK系统能将Otof^-/-小鼠的听力阈值改善至55-70分贝，其效果优于AAV1-AP和AAV1-TS系统。然而，基于蛋白质剪接的AAV1-intein系统表现更为突出，能将听力阈值恢复至35-70分贝，优于AAV1-AK系统，并且这种治疗效果在新生和成年小鼠中均可维持至注射后12个月。

耳蜗蛋白重新表达与突触修复效果

在分子和细胞水平上，AAV1-intein系统介导的耳蜗蛋白重新表达效率更高。同时，该系统中耳蜗带状突触的数量恢复和功能修复程度也显著优于AAV1-AK系统，这表明蛋白质剪接策略在重建听觉突触传递方面更具优势。

蛋白质重组与核酸重组的效率比较

综合各项实验结果，本研究得出结论：在DFNB9的基因治疗中，基于蛋白质剪接（内含肽介导）的重组策略比基于核酸（RNA）剪接的策略更为高效。AAV1-intein系统不仅实现了更优且持久的听力恢复，还在细胞水平上更有效地修复了听觉通路中的关键结构——带状突触。

这项研究的重要意义在于，它首次在体内系统地比较了不同双AAV重组策略在遗传性耳聋基因治疗中的效果，明确揭示了蛋白质剪接相对于传统核酸剪接的优越性。该发现不仅为优化DFNB9的基因治疗提供了关键实验数据，更重要的是，为其他因尺寸过大而无法由单个AAV载体装载的基因的递送提供了新的思路和技术参考。通过证明蛋白质水平重组的高效性，本研究推动了大基因治疗策略的发展，有望惠及更多因大基因缺陷导致的遗传性疾病患者。