新型原卟啉原氧化酶抑制剂通过促进红细胞生成而非直接遗传毒性诱导微核形成的证据

本研究针对新型PPOi除草剂在体内诱导微核形成的机制难题，通过整合体外致突变性测试、体内多组织微核试验及彗星实验等技术手段，首次证实该化合物通过刺激红细胞生成（而非直接DNA损伤）导致微核形成，为农药安全性评价中假阳性结果的甄别提供了重要理论依据。

　　

在农药安全性评价领域，原卟啉原氧化酶抑制剂（PPOi）类除草剂一直存在一个令人困惑的现象：这类化合物在体外遗传毒性测试中通常表现为阴性，却在啮齿类动物体内微核试验中呈现阳性结果。这种矛盾现象给农药注册评审和风险评估带来巨大挑战。传统观点认为，微核形成是遗传毒性的直接证据，但越来越多的研究表明，某些非遗传毒性机制也可能导致微核形成，其中红细胞生成加速被认为是一个重要因素。

近期发表在《Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis》的一项研究深入探讨了这一问题。研究人员以一种新型PPOi开发候选物为研究对象，通过系统性的实验设计揭示了该化合物诱导微核形成的真实机制。

本研究采用的技术方法主要包括：Ames试验（使用鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌WP2 uvrA菌株）、体外微核试验（使用人外周血淋巴细胞）、HPRT基因突变试验（使用CHO细胞）、体内微核试验（使用C57BL/6小鼠和Sprague Dawley大鼠）以及组合微核/彗星试验（使用NMRI小鼠）。动物实验均在AAALAC认证设施中进行，部分研究遵循GLP规范。特别值得注意的是，研究人员通过磁性激活细胞分选技术（MACS）成功分离了骨髓中的CD45⁺（非红细胞系）和Ter119⁺（红细胞系）细胞亚群。

3.1. 试验有效性

所有试验均符合OECD指南的有效性标准，阴性对照组结果在实验室历史对照数据的95%控制限内，阳性对照组均显示出统计学显著性效应。

3.2. 体外致突变性试验

Ames试验中，测试物质在最高浓度下出现沉淀，但未引起回复突变菌落数的相关增加。体外微核试验中，测试物质在选定的最高浓度下未显示相关细胞毒性，微核率无统计学显著增加。HPRT试验同样显示突变率无浓度相关性增加。所有体外致突变性数据均未显示测试物质具有致突变潜力。

3.3. 筛选性体内微核试验

膳食给予1500和5000 ppm测试物质14天后，高剂量组出现统计学显著的体重减轻。临床病理学检查显示，两个剂量组均出现红细胞、血红蛋白、血细胞比容和绝对网织红细胞减少，表明测试物质引起了贫血。高剂量组促红细胞生成素水平升高15倍。骨髓评估显示，高剂量组微核多染红细胞（PCE）率显著增加（0.79% vs 对照组0.18%）。

3.4. 肝脏和骨髓联合微核试验

大鼠经口给予100、300和1000 mg/kg/天测试物质14天后，300和1000 mg/kg剂量组骨髓微核率显著增加，且呈剂量依赖性。相反，肝细胞中未观察到微核增加。测试物质未降低有丝分裂指数，但增加了肝细胞增殖，表明化合物到达了两种组织并产生效应。

3.5. 体内联合微核试验和彗星试验

小鼠单次口服100-2000 mg/kg测试物质后，24小时制备间隔的骨髓样本显示PCE数量显著下降至对照组值的50%。48小时时骨髓恢复。微核评估显示24小时制备间隔时微核PCE呈剂量相关性增加。彗星试验结果显示，DNA损伤仅局限于Ter119⁺红细胞系细胞中，而CD45⁺非红细胞系细胞和未分选的骨髓细胞均未显示尾部DNA强度增加。

研究结论表明，新型PPOi在体外无致突变性，但在体内诱导贫血的剂量下可引起骨髓微核形成。通过比较骨髓（造血组织）和肝脏（非造血组织）的反应，以及分析骨髓中不同细胞亚群的DNA损伤，研究人员证实微核形成仅限于红细胞系细胞，且与DNA损伤仅出现在红细胞系细胞亚群中的现象一致。这表明该PPOi诱导的微核形成很可能是由贫血引起的红细胞生成加速所致，而非直接遗传毒性作用。

这项研究的重要意义在于它为农药安全性评价提供了重要的机制洞察。首先，研究证实了某些PPOi类化合物在体内微核试验中的阳性结果可能是一种假阳性现象，由非遗传毒性机制引起。其次，研究建立了一套系统的评估策略，通过结合多种体外和体内试验方法，能够有效区分真正的遗传毒性和由生理变化引起的假阳性结果。最后，该研究为 regulatory agencies 在评估类似化合物时提供了科学依据，有助于更准确地进行风险评估和决策制定。

研究人员在讨论中指出，红细胞生成加速导致微核形成的机制尚未完全明确，但可能与红细胞前体细胞去核成为未成熟红细胞的过程有关。这与之前使用重组人促红细胞生成素的研究结果一致，但新型PPOi诱导的效应更为明显，可能与贫血严重程度和补偿性红细胞生成的强度有关。

这项由Naveed Honarvar、Astrid Zander、Miyuki Shigano等作者完成的研究，不仅解决了一个具体的毒理学机制问题，更重要的是为整个农药安全性评价领域提供了方法论上的创新和理论上的突破，对未来类似化合物的评价具有重要的指导意义。