聚单宁酸纳米球通过氧化还原驱动机制调控三阴性乳腺癌细胞机械生物学行为抑制侵袭转移

本研究针对三阴性乳腺癌（TNBC）侵袭性强、缺乏靶向治疗的临床难题，开发了聚单宁酸（pTA）纳米球新型抗氧化纳米材料。研究发现pTA纳米球通过重塑细胞骨架结构、改变线粒体代谢特性并诱导MT1-MMP蛋白酶空间重定位，显著抑制TNBC细胞迁移侵袭能力而不引发细胞凋亡，为术后转移控制提供了非致死性纳米治疗新策略。

　　

在乳腺癌治疗领域，三阴性乳腺癌（TNBC）因其侵袭性强、易转移复发且缺乏有效靶向治疗手段，成为临床治疗的重大挑战。化疗后残留的肿瘤细胞往往表现出更强的侵袭性和转移能力，导致治疗失败和癌症复发。当前临床实践中，虽然采用免疫增强剂或活性氧（ROS）调节剂等辅助手段试图清除残余癌细胞，但效果有限。抗氧化剂作为辅助治疗剂备受关注，因其能够改变氧化还原敏感信号通路，通过限制脂质过氧化和细胞内氧化应激诱导肿瘤细胞凋亡。

为了最大化抗氧化辅助剂的抗转移潜力，研究人员提出将抗氧化单元分子组装成纳米结构可增强其细胞内活性和靶向递送效率。天然多酚类化合物以其酚羟基的氢原子捐赠能力而具有显著的ROS清除能力。单宁酸（TA）作为一种可水解多酚，即使在生理应激条件下也表现出环境稳定性和持续抗氧化活性。前期研究表明，TA纳米载体涂层能够重塑癌细胞细胞骨架结构，这为通过氧化还原调节抑制转移行为提供了新思路。

在这项发表于《Nano Today》的研究中，韩国延世大学医学院放射科的研究团队通过间苯二酚-甲醛辅助聚合方法开发了聚单宁酸（pTA）纳米球，构建了每个颗粒由多个TA分子组成的自组装结构。这种设计不仅增强了抗氧化效力，还因纳米级形态因子提高了细胞内化效率。与传统的多酚基纳米载体不同，pTA纳米球完全由聚合单宁酸结构组成，每个纳米颗粒具有极高的多酚含量，能够实现持续的抗氧化活性和氧化还原调节。

研究人员采用多种先进技术方法开展本研究：通过场发射扫描电镜和透射电镜表征纳米球形态；使用傅里叶变换红外光谱和核磁共振验证化学结构；采用循环伏安法分析氧化还原特性；通过Seahorse能量代谢分析系统评估线粒体功能；利用共聚焦和STED超分辨率显微镜观察细胞骨架和细胞器结构；应用实时细胞分析系统监测迁移侵袭动态；采用Western blot分析蛋白表达变化。所有实验均使用MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞系，进行至少三次独立重复实验。

3.1. 纳米球形聚单宁酸的制备与表征

研究人员采用改良的St?ber方法通过甲醛交联制备pTA纳米球。扫描电镜显示在高甲醛浓度下合成的pTA呈现均匀球形形态，平均直径为110.5±12 nm。傅里叶变换红外光谱确认了TA特征官能团的保留，核磁共振谱显示CH₂质子信号从δ=9.5到δ=4.3的位移，表明通过甲醛介导的聚合成功引入了亚甲基连接。热重分析显示pTA熔点超过300°C，表明聚合后热稳定性显著增强。

3.2. pTA纳米球的放大抗氧化活性

总酚含量测定表明pTA组成中73.94±4.6%为TA。紫外-可见分光光度法确认TA在275 nm的特征吸收峰在pTA中保持不变，表明抗氧化特性的保留。循环伏安分析显示pTA表现出具有较低氧化电位的不可逆氧化峰，表明氧化稳定性和抗性增强。定量抗氧化实验证明pTA在0.031 mg/mL浓度下达到约90%的抗氧化效率，显示出卓越的自由基清除能力。

3.3. pTA纳米球对细胞增殖和核形态的抗氧化影响

pTA纳米球处理显著抑制MDA-MB-231细胞增殖，呈剂量依赖性。高含量荧光成像显示在≥0.125 mg/mL浓度下核数量明显减少，表明pTA纳米球通过抑制细胞周期进展或诱导静止状态发挥强效抗增殖作用。核形态计量分析显示，虽然核面积和周长保持相对稳定，但核圆度随pTA纳米球剂量增加而逐渐增加，表明向更球形核形态转变，反映了细胞骨架松弛或染色质凝聚。

3.4. pTA处理破坏细胞骨架结构和粘着斑动力学

pTA纳米球处理诱导细胞骨架组织和机械表型的显著变化。双免疫荧光染色显示，处理细胞表现出更各向同性和扁平的形态，伴随解组的肌动蛋白网络和皮质F-肌动蛋白的显著减少。纽蛋白染色变得更加分散，点状定位消失，表明粘着斑解组装。Z栈重建和强度线分析进一步证实了极化肌动蛋白结构的丢失和基底膜附近肌动蛋白积累的减少。

3.5. 抗氧化应激下的MT1-MMP空间重编程

多通道共聚焦成像和定量空间分析显示，在对照组细胞中，MT1-MMP优先定位于F-肌动蛋白富集的突起处，与其在侵袭前沿局部基质降解中的作用一致。然而，pTA处理后，MT1-MMP从 periphery 重新分布并在核周区域更弥漫地积累。共定位分析表明处理细胞中F-肌动蛋白和MT1-MMP之间的重叠减少，提示蛋白酶靶向肌动蛋白基结构的过程被破坏。

3.6. 抗氧化pTA破坏细胞骨架协调和ECM重塑

在3D明胶降解实验中，对照细胞显示突出的侵袭伪足样结构和局部明胶降解，表明活跃的ECM重塑。相比之下，pTA处理细胞表现出显著减少的F-肌动蛋白富集突起和最小ECM降解，表明基质降解活性受到抑制。实时xCELLigence分析显示，迁移和侵袭均受到抑制，但在侵袭实验中抑制效果更为明显，表明pTA不仅抑制运动性，还抑制基质重塑能力。

3.7. pTA纳米球驱动的氧化还原线粒体重塑和代谢重编程

Mito Stress Assay显示基础氧消耗率（OCR）显著下降，从对照细胞的约50 pmol/min/10,000细胞降至pTA处理后的32 pmol/min/10,000细胞。最大呼吸也减少了近50%，反映了线粒体储备能力的损失。细胞外酸化率（ECAR）从9降至8 mpH/min/10,000细胞。ATP Rate Assay显示糖酵解和线粒体来源的ATP合成均减少，特别是线粒体ATP生产从46显著降低至9 pmol/min。

细胞内谷胱甘肽氧化还原分析显示，pTA纳米球处理后，还原型（GSH）和氧化型（GSSG）谷胱甘肽水平协调降低，总谷胱甘肽含量也减少，表明谷胱甘肽依赖性抗氧化周转受到全局抑制。DCFDA染色显示荧光强度从100%（对照）降至约40%，证实pTA有效降低氧化应激。

共聚焦和STED超分辨率成像显示，pTA纳米球处理后，β-微管蛋白（绿色）和线粒体（红色）的组织均发生显著改变。在未处理细胞中，线粒体主要聚集在核周围，形成紧密的核周聚集物，与高ATP输出和ROS生成相关。相比之下，pTA处理细胞表现出更广泛分布的微管网络，清晰勾勒出核轮廓。线粒体不再集中，而是沿着微管蛋白丝向细胞 periphery 延伸，表明细胞骨架引导的重新定位远离高能量需求区。

透射电镜（TEM）提供了超微结构证据支持氧化还原诱导的线粒体和代谢重塑。在处理细胞中，线粒体表现出明显肿胀，电子致密囊泡区室比未处理对照更丰富，与应激适应表型一致。Western blot分析进一步证实了pTA纳米球诱导的氧化还原驱动应激适应。抗氧化传感器和解毒酶（Keap1、Nrf2、PRX2和SOD2）在处理后变化极小。相比之下，GPX4水平显著降低，暗示对脂质过氧化物解毒的需求降低。

研究结论表明，聚单宁酸（pTA）纳米球作为完全由单宁酸单体组装的纳米结构，在TNBC细胞中表现出有效的细胞内抗氧化作用。除了抑制增殖外，pTA处理破坏了核和细胞形态，改变了细胞骨架结构（F-肌动蛋白、波形蛋白），并重新分布了MT1-MMP（基质降解和侵袭中的关键蛋白酶）。这些变化伴随着线粒体重塑和氧化磷酸化减少，突出了氧化还原驱动的细胞力学和代谢调节。

通过采用涵盖高分辨率成像、空间蛋白酶定位、代谢分析和超微结构分析的多模式分析方法，研究人员阐明了一个机制通路，通过该通路氧化还原调节限制了侵袭行为。这种体外分析支持pTA纳米球作为氧化还原靶向的抗转移剂的潜力，这些试剂通过调节机械和生化癌症特征发挥作用。这些发现为开发氧化还原调节纳米材料奠定了基础，这些材料通过靶向侵袭癌细胞的机械和代谢脆弱性来抑制转移。