梭杆菌谱系分析揭示非核酸梭杆菌与结直肠癌的关联：L1/L5谱系的临床价值

《npj Biofilms and Microbiomes》：Fusobacterium lineage profiling facilitates the clarification of the associations between non-nucleatum Fusobacterium and colorectal cancer

本研究针对结直肠癌（CRC）中梭杆菌（Fusobacterium）检测特异性不足的问题，开发了基于谱系特异性标记的FL-typing方法，发现传统qPCR高估F. nucleatum丰度而实际反映L1谱系水平。通过多队列验证，L1在CRC中显著富集且预测价值优于单一物种，L5与淋巴血管浸润（LVI）相关。研究强调了在梭杆菌多样性高的群体中，非核酸梭杆菌通过共享毒力基因参与CRC的机制，为精准诊断和机制研究提供新工具。

　　

梭杆菌（Fusobacterium）作为人类肠道微生物组中的重要成员，近年来被广泛报道与结直肠癌（CRC）的发生和发展密切相关。其中，Fusobacterium nucleatum（F. nucleatum）作为该属中研究最深入的物种，被发现富集于CRC组织并通过多种机制促进肿瘤进展。然而，随着研究的深入，越来越多的证据表明，非核酸梭杆菌（non-nucleatum Fusobacterium）在CRC中的作用不可忽视，尤其在肠道梭杆菌群落多样性较高的群体（如中国南方人群）中，这些菌种可能通过携带同源毒力因子（如FadA）参与疾病进程。

值得注意的是，梭杆菌属包含多个进化上 distinct 的谱系（Lineage, L）。近期研究通过基于rpoB基因的测序技术（FrpoB-seq）将梭杆菌划分为9个遗传谱系（L1-L9），其中L1（包含F. nucleatum、F. periodonticum、F. pseudoperiodonticum等）和L5（以F. varium和F. ulcerans为代表）在肠道中频繁检出，且与CRC呈现特异性关联：L1在CRC中富集，而L5与淋巴血管浸润（LVI）相关。然而，当前临床检测中广泛采用的qPCR引物组（Fn-F/R）靶向nusG基因，其特异性不足，可能同时检测L1内的多个物种，导致F. nucleatum的丰度被高估。此外，随着分类学更新，原先F. nucleatum的四个亚种已被提升为独立物种（如F. animals、F. polymorphum等），进一步凸显了在谱系层面进行精准检测的必要性。

为了解决上述问题，研究团队开发并验证了一种名为FL-typing（Fusobacterium lineage typing）的PCR检测方法，用于精准定量L1和L5谱系，并重新评估了它们与CRC的关联及其临床价值。

关键技术方法概述

研究首先通过比较基因组分析（157个梭杆菌基因组）筛选出L1和L5特异的遗传标记，设计通用引物，建立优化qPCR条件（FL-typing）。使用模拟群落（含F. nucleatum ATCC 25586、F. periodonticum THCT14E2等）和临床样本（粪便和组织来自上海第十人民医院生物样本库的CRC患者与健康对照）验证特异性与灵敏度。通过FrpoB-seq和公开宏基因组数据（包括中国、日本、欧美等8个队列）进行交叉验证。利用微生物共现网络分析（FastSpar）揭示L1/L5的生态互作模式。

研究结果

1. 广泛使用的引物无法准确检测肠道微生物组中“F. nucleatum”的丰度

通过对比临床样本中Fn-F/R qPCR结果与FrpoB-seq数据，发现qPCR结果与“F. nucleatum”的相对丰度仅呈中度相关（粪便样本Spearman's rho=0.617，组织样本=0.591），而与L1丰度高度相关（粪便样本r=0.843，组织样本r=0.863）。

在模拟L1群落实验中，Fn-F/R的qPCR信号与样本中L1总菌量相关，而非F. nucleatum单独占比，证实其在实际检测中反映的是L1水平。

2. 通过比较基因组分析鉴定L1和L5特异性标记

从157个梭杆菌基因组中筛选出3个L1特异性标记（如L1_746）和5个L5特异性标记（如L5_1621），这些标记在各自谱系内高度保守，在其他谱系中完全缺失。

3. 基于PCR的梭杆菌谱系检测方法的开发

针对L1_746和L5_1621设计引物，优化反应条件。qPCR显示Ct值与细菌负载量（log₁₀CFU）线性相关，且在复杂微生物背景中稳定性良好。

FL-typing在临床样本中与FrpoB-seq结果高度一致（L1：r=0.950，L5：r=0.932），灵敏度（L1：98.2%，L5：96.4%）和特异性（L1：100%，L5：96.6%）优良。

4. 使用FL-typing验证L1和L5在CRC中的特异性关联

在新收集的临床样本中（粪便：60例CRC vs 53例对照；组织：100对癌与癌旁），L1在CRC患者粪便和肿瘤组织中显著富集，而L5水平在LVI阳性肿瘤中更高。

5. L1的丰度比“F. nucleatum”更能预测CRC

通过ROC和PR曲线分析，L1在多个队列（包括中国、日本、欧美人群）中预测CRC的AUC值显著高于“F. nucleatum”。在梭杆菌多样性高的群体中，L1的预测优势更明显。

6. 毒力和定植相关遗传决定因子由L1中“F. nucleatum”以外的物种共享

毒力基因（fadA、fap2、fusolisin等）和代谢操纵子（eut、pdu）在L1多个物种中广泛存在，提示L1谱系通过共享的致病机制集体参与CRC。

7. L1和L5与其他细菌的不同共现模式

网络分析显示，L1与口腔来源的细菌（如链球菌、Gemella）正相关，倾向于形成生物膜；而L5与肠道共生菌（如拟杆菌、瘤胃球菌）关联，体现不同的生态策略。

结论与意义

本研究通过开发FL-typing方法，证实了梭杆菌谱系L1和L5在CRC中的特异性作用：L1富集于CRC且预测价值优于单一物种“F. nucleatum”，而L5与肿瘤侵袭性相关。研究揭示了传统检测方法的局限性，强调了在梭杆菌多样性高的群体中，非核酸梭杆菌通过共享毒力基因（如eut/pdu操纵子）参与CRC的集体致病模式。FL-typing为CRC的微生物标志物检测提供了更精准的工具，并为阐释谱系特异性致病机制奠定基础。未来需在多中心、大样本中进一步验证，并结合功能实验深入探索L1/L5的致病通路。论文发表于《npj Biofilms and Microbiomes》，为肠道微生物组在肿瘤中的作用提供了新的视角。