《Piel》：Natural-product repurposing for novel reactive oxygen species inducer discovery: bactericidal profiling and structure-activity relationship of ellipticine and its analogs
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椭圆体作为天然产物被发现对水稻细菌性叶枯病病原菌具有显著抗菌活性，其EC50值较传统杀菌剂铜硫丹低113倍，通过诱导胞内ROS爆发触发细菌凋亡及膜结构破坏，同时展现优异药物-like性质。
Jingsha Yang|Guoqing Wang|Yi He|Wan Chen|Hongwu Liu|Linli Yang|Dan Zeng|Zhibing Wu|Liwei Liu|W.M.W.W. Kandegama|Zhenbao Luo|Xiang Zhou|Song Yang
中国-斯里兰卡茶叶生态控制 Belt and Road 联合实验室（TEC）绿色农药国家重点实验室，贵州大学精细化学品研发中心，中国贵阳，550025
摘要
开发针对氧化应激诱导的治疗剂以破坏细菌的氧化还原防御机制已成为抗菌研究中的重要策略。为了增加用于控制细菌感染的活性氧（ROS）诱导剂的结构性多样性，采用了一种天然产物再利用策略，通过该策略发现了一种从植物中提取的生物碱——椭圆霉素（ellipticine），它对感染水稻的Xanthomonas oryzae pv. oryzae具有显著的抗菌活性。值得注意的是，椭圆霉素对Xanthomonas oryzae pv. oryzae的抗菌活性（EC50 = 0.71 ± 0.12 μg/mL）明显优于对照药物噻二唑铜（TC，EC50 = 80.38 ± 1.36 μg/mL），效果提高了113倍。机制研究表明，椭圆霉素在细菌细胞内引发了剧烈的ROS爆发，触发了细菌的凋亡过程并破坏了细胞膜的完整性。此外，使用水稻模型进行的验证实验进一步表明，椭圆霉素对细菌性叶枯病的保护效果为52.75%，治愈效果为47.26%，几乎是TC（保护效果：28.55%；治愈效果：26.47%）的两倍。此外，椭圆霉素还表现出良好的药物特性。这是首次报道椭圆霉素作为一种通过ROS介导的杀菌机制的植物源杀菌剂候选物，为新型杀菌剂的开发提供了重要范例。这项研究不仅填补了在天然产物开发中理解ROS介导的抗菌机制方面的关键空白，还为针对ROS途径设计抗菌分子奠定了理论基础。
引言
植物细菌性疾病已成为全球农业生产力的严重威胁，导致农作物产量遭受重大经济损失[1,2]。例如，仅由Xanthomonas oryzae pv. oryzae引起的水稻细菌性叶枯病每年就导致中国超过2420万吨的产量损失，且受影响的作物恢复潜力极低[3,4]。不幸的是，传统的杀菌剂如双甲基噻唑和噻二唑铜（TC）由于环境兼容性不佳以及病原体抗性的迅速出现而面临越来越多的限制，严重影响了其田间效果。这些挑战凸显了迫切需要具有新型作用机制的创新杀菌剂[5]。
针对细菌的活性氧（ROS）系统是一种新兴的抗菌策略，它通过控制细胞内ROS水平的升高来破坏微生物的氧化还原平衡[6,7]（图1）。这种有针对性的氧化扰动会引发一系列生化反应，包括蛋白质变性、脂质过氧化和DNA损伤，从而激活细菌病原体的程序性细胞死亡反应[8,9]。有趣的是，抑制/增强内源性抗氧化系统、调节氧化还原调节蛋白[10,11]以及应用小分子ROS诱导剂可以降低与传统杀菌剂相关的抗性发展风险，因为这些方法能够提高细胞内的ROS水平[12,13]。因此，针对细菌的ROS调节系统是一类有前景的杀菌靶点，既能缓解抗性进化，又能有效规避现有的抗菌机制。
目前，由于天然产物及其衍生物在结构上的多样性和生物学特性，它们仍然是创新药物和农用化学品开发中不可或缺的资源。咔唑类生物碱是一类结构多样的植物化学物质，具有从抗菌到抗病毒等多种生物活性[[14], [15], [16], [17], [18]]。机制研究表明，特定的咔唑和β-咔啉衍生物通过ROS介导的杀菌机制发挥抗菌作用[19,20]。然而，针对新的基于生物碱的ROS诱导剂及其分子机制的系统研究仍然不足。椭圆霉素是一种具有独特吡啶-咔唑结构的双杂环生物碱，在抗癌应用中显示出治疗潜力[21,22]，但其抗菌效果和潜在的ROS诱导机制仍需进一步研究以探索其杀菌应用。
为了增加ROS诱导剂的结构性多样性，在本项目初期对多种天然生物碱进行了广泛筛选，并确定了椭圆霉素（图1）作为一种具有显著研究潜力的化合物。在本研究中，系统地研究了玫瑰木生物碱的抗菌效力及其作用机制。具体而言，采用天然产物再利用策略评估了椭圆霉素及其咔唑衍生物的抗菌活性和构效关系，探讨了咔唑环上不同位置取代基对其抗菌效果的影响。综合的抗菌活性数据和初步的机制结果表明，椭圆霉素是一种有前景的新型ROS诱导剂。这一发现不仅为发现高潜力的植物源杀菌剂提供了创新策略，也为新型咔唑类杀菌剂的合理药物设计提供了关键指导。
仪器和化学品
所有试剂均为商业购买。光密度（OD）值使用Cytation? 5 Multi-Mode Reader（BioTek Instruments, Inc., 美国）进行测量。活性氧（ROS）水平通过荧光检测法测定，并使用Olympus-BX53显微镜（Olympus, 东京，日本）进行可视化观察。扫描电子显微镜（SEM）图像使用Nova Nano SEM 450仪器（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, 美国）获取。
体外
系统评估了椭圆霉素及其十二种咔唑衍生物的
体外抗菌活性。如图2和表1所示，大多数化合物在25 μg/mL浓度下对Xanthomonas oryzae pv. oryzae表现出中等至优异的抗菌活性，但对Xanthomonas axonopodis pv. citri和Pseudomonas syringae pv. actinidiae的抗菌效果较差。总体抑制率一般
结论
本研究确定植物来源的生物碱椭圆霉素是一种高效的抗菌剂，其对Xanthomonas oryzae pv. oryzae的抗菌效果（EC50 = 0.71 ± 0.12 μg/mL）显著优于商业杀菌剂TC（EC50 = 80.38 ± 1.36 μg/mL），效果提高了约113倍。机制研究（图10）表明，椭圆霉素在细菌细胞内引发了ROS的爆发，触发了细菌凋亡并破坏了细胞膜
CRediT作者贡献声明
Jingsha Yang：撰写——初稿，数据整理，概念构思。Guoqing Wang：撰写——初稿，数据整理，概念构思。Yi He：撰写——初稿，数据整理，概念构思。Wan Chen：实验研究。Hongwu Liu：实验研究。Linli Yang：实验研究。Dan Zeng：实验研究。Zhibing Wu：验证。Liwei Liu：验证。W.M.W.W. Kandegama：实验研究。Zhenbao Luo：撰写——审稿与编辑，资源协调，项目管理。Xiang Zhou：撰写——
资助
本研究得到了国家重点研发计划（编号：2024YFE0214300）、国家自然科学基金（编号：32372610, U23A20201, 32160661, 32202359）、国家重点研发计划（编号：2022YFD1700300）、中央政府引导地方科技发展基金项目[Qiankehezhongyindi [2023]001]和[Qiankehezhongyindi [2024]007]以及毕节烟草项目（编号：2024SMXM02）的财政支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
