功能性AOMT1基因与启动子变异协同调控葡萄品种间甲氧基化花青素积累的分子机制

本研究针对葡萄品种间甲氧基化花青素积累差异的分子机制不明确的问题，通过系统解析VvAOMT1基因功能与启动子活性，发现尽管有色与无色品种的AOMT1均具备催化活性，但启动子区MBS（MYB结合位点）的自然变异导致MYBA1反式激活能力差异，从而调控AOMT1表达水平和甲氧基化花青素积累。该研究为葡萄果实色泽分子育种提供了重要理论依据。

　　

花青素作为植物界广泛存在的次生代谢产物，不仅赋予花卉和果实绚丽的色彩以吸引传粉者和种子传播者，更在植物抵御紫外线辐射、病原侵染和极端温度等环境胁迫中扮演着关键角色。对于人类而言，花青素具有抗氧化、抗炎以及预防慢性疾病等多种健康益处。花青素的甲氧基化（Methoxylation）是一种关键的酶促修饰过程，由花青素O-甲基转移酶（Anthocyanin O-methyltransferases, AOMTs）催化完成。这一修饰能够显著改变花青素的化学结构和性质，增强其稳定性、溶解性、色泽和功能活性。在葡萄（Vitis vinifera）这种具有重要经济价值和营养意义的水果作物中，果实色泽的多样性很大程度上归因于花青素的组成和积累，而甲氧基化模式（单甲氧基化或二甲氧基化）是造成品种间色泽差异的关键因素。然而，尽管AOMT的功能及其与转录因子MYBA1的协同作用在花青素生物合成中已被初步探讨，但导致有色与无色葡萄品种间甲氧基化花青素积累差异的分子调控机制，尤其是启动子层面的调控机制，至今仍不甚明了。

为了深入解析这一科学问题，由南京农业大学园艺学院卢素文研究员团队领导的研究小组在《Plant Physiology and Biochemistry》上发表了一项综合性研究。研究人员以多个葡萄品种为材料，综合运用了基因克隆与生物信息学分析、定量实时荧光PCR（qRT-PCR）、花青素提取与测定（采用UPLC进行定性和定量分析）、烟草叶片瞬时转化与稳定转化、体外酶活测定、启动子活性分析（GUS报告系统）以及凝胶阻滞实验（EMSA）等关键技术方法。样本来源于位于中国南京的试验 vineyard，包括‘Italia’（IT, 无色）、‘Shine Muscat’（SM, 无色）、‘Wink’（WK, 有色）和‘Kyoho’（KY, 有色）等12个品种的成熟期果实，以及本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片。

研究结果从多个层面揭示了AOMT1的功能及其调控机制：

Grape AOMT1 has conserved gene structure characteristics and motif characteristics

系统发育、基因结构和保守 motif 分析表明，葡萄AOMT1与其他果树物种（如玫瑰、草莓、苹果）的OMT蛋白高度同源，均包含5个外显子和4个内含子，且蛋白质序列中包含7个高度保守的motif，其中包括S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine, SAM）的结合位点Methyltransf_3结构域，提示其功能在进化上相当保守。

AOMT1 expression correlates with skin color and anthocyanin accumulation across grape cultivars

表达分析显示，AOMT1的转录水平与花青素积累和果皮颜色密切相关。在深色（紫色/黑色）品种中表达量最高，在浅色（红色）品种中表达较低，而在无色品种中几乎不表达。然而，其表达与总花青素或甲氧基化花青素含量的直接相关性较弱，暗示其表达是甲氧基化发生的必要条件而非充分条件。

Coexpression of AOMT1 and MYBA1 increase methoxylated anthocyanin accumulation

AOMT1 from both colored and colorless cultivars can catalyze the methoxylation of anthocyanins

AOMT1 from both colored and colorless cultivars exhibit enzymatic activities on anthocyanins

功能验证实验是本研究的核心。通过烟草瞬时共表达系统，研究人员发现单独表达MYBA1可诱导烟草叶片积累非甲氧基化花青素（如delphinidin 3-O-rutinoside），使叶片呈深红色；而当MYBA1与来自任何品种（包括无色品种IT和SM）的AOMT1共表达时，均能显著提高甲氧基化花青素（主要是malvidin衍生物）的比例（约增加30%），并使叶片颜色变为亮红色。稳定转基因烟草实验和体外酶活实验进一步证实，尽管不同品种的AOMT1蛋白序列存在氨基酸差异，但它们均能有效催化底物cyanidin和delphinin转化为其甲氧基化产物peonidin、petunidin和malvidin。这雄辩地证明，有色和无色品种的AOMT1编码的酶在功能上是保守且具备催化活性的。

Sequence variations in the AOMT1 promoter among grape cultivars

The AOMT1 promoter from colored grape cultivars exhibits higher activity than that from colorless cultivars

MBS variations in the AOMT1 promoter alter MYBA1 binding affinity

既然酶功能保守，那么表达差异的根源很可能在调控层面。研究人员对四个品种的AOMT1启动子区（~1310 bp）进行了分析，发现了大量的单核苷酸多态性（SNPs）和插入缺失（Indels），特别是在预测的MYB结合位点（MBS）区域。启动子活性分析（GUS报告系统）显示，来自有色品种KY和WK的启动子活性显著高于无色品种IT和SM。EMSA实验进一步揭示，关键转录因子MYBA1与不同品种启动子中特定MBS（如MBS1, MBS3, MBS4, MBS5）的结合亲和力存在显著差异。其中，MYBA1与KY来源的MBS1结合最强，与IT的结合次之，与SM的结合最弱。SM启动子中MBS5的缺失也直接削弱了MYBA1的结合能力。这些自然变异直接导致了MYBA1对AOMT1启动子的反式激活（transactivation）能力不同，最终造成品种间AOMT1表达水平的差异。

综上所述，本研究得出的核心结论是：葡萄品种间甲氧基化花青素积累的差异并非源于AOMT1编码序列的功能丧失性变异，而是由其启动子区域的自然序列变异所主导。这些变异，特别是MBS元件的差异，影响了核心转录因子MYBA1的结合亲和力与反式激活效率，从而导致AOMT1基因在有色品种中高表达、在无色品种中低或不表达，最终决定了甲氧基化花青素的积累水平。

该研究的讨论部分强调了这一发现的重要意义。首先，它阐明了转录调控在葡萄果实色泽形成中的精细调控机制，为理解植物次生代谢产物积累的种内变异提供了经典范例。其次，研究指出尽管无色品种的AOMT1不表达，但其编码序列却得以保留，这暗示该基因可能还具有花青素甲基化之外的其他未知功能（如参与其他代谢途径或胁迫响应），或者其表达沉默是近期进化事件，这些都为后续研究提供了新方向。最后，从应用角度出发，该研究为葡萄分子育种提供了精准的靶点。通过筛选具有高活性启动子单倍型（haplotype）的种质资源，或利用基因组编辑技术对AOMT1的调控区域进行精准修饰，有望定向培育出果色艳丽、花青素稳定性更佳的新品种，以满足市场和环境的需求。