四价融合蛋白疫苗对产气荚膜梭菌坏死性肠炎的保护效力研究

本研究针对家禽坏死性肠炎（NE）缺乏高效商业疫苗的难题，设计了一种包含NetB毒素、α毒素、CnaA黏附素和ZmpB金属蛋白酶片段的新型四价（QV）融合蛋白疫苗。实验证明，该QV蛋白能诱导针对所有四种抗原的抗体反应，并显著降低攻毒后肉鸡肠道病变评分（p < 0.05），为开发高效NE疫苗奠定了基础。

　　

在现代化家禽养殖业中，坏死性肠炎（Necrotic Enteritis, NE）是一种由产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）引起的、导致巨大经济损失的肠道疾病。长期以来，抗生素是控制该病的主要手段，但随着抗生素耐药性担忧的加剧以及部分地区对抗生素使用的限制，寻找有效的替代防控方案变得尤为迫切。疫苗被认为是理想的替代策略之一。然而，尽管科研人员已经识别出NetB毒素这一关键毒力因子，但以其为靶点的单组分疫苗仅能提供部分保护，效果不尽如人意。这提示我们，NE的发病机制复杂，涉及多种毒力因子协同作用，因此，针对单一靶点的免疫策略可能不足以提供全面保护。在此背景下，开发一种能够同时靶向多个关键毒力因子的多价疫苗，成为了一个极具潜力的研究方向。

为了应对这一挑战，研究人员将目光投向了多抗原疫苗的构建。本研究旨在设计并评估一种新型的四价（Quadrivalent, QV）融合蛋白疫苗，该疫苗同时包含了NetB毒素（关键毒力因子）、α毒素（历史认为的主要毒力因子）、CnaA胶原黏附素（与细菌定植相关）和ZmpB锌金属蛋白酶（参与组织损伤）的免疫原性片段。研究人员期望通过激发针对多个毒力因子的协同免疫反应，实现对肉鸡更有效的保护，为开发高效、实用的NE商业疫苗提供坚实的实验依据。相关研究成果发表在《Poultry Science》上。

为开展本研究，研究人员运用了多项关键技术。首先，通过生物信息学工具（如IEDB、Phobius、AlphaFold）进行抗原表位预测、蛋白结构域分析和三维结构建模，以合理设计QV融合蛋白。其次，利用基因合成和原核表达系统（大肠杆菌BL21(DE3)）制备了重组QV蛋白及各单一抗原蛋白，并通过镍柱亲和层析进行纯化。动物实验采用特定病原自由（SPF）的商业肉鸡（Ross 308），实验方案经动物伦理委员会批准。疫苗接种采用皮下注射方式，使用CSIRO三联佐剂进行乳化。NE疾病模型通过给饲高蛋白鱼粉饲料并口服强毒力产气荚膜梭菌菌株WER-NE36来建立。免疫效果通过肠道病变评分（评估保护效力）以及Western blot和ELISA（检测血清IgY抗体反应）进行评估。统计分析使用GraphPad Prism软件进行。

Epitope Prediction of Individual and QV Vaccine Candidates

研究人员首先通过生物信息学分析，为QV蛋白筛选合适的抗原片段。为了避免表达问题，去除了预测的信号肽和跨膜结构域。对于CnaA黏附素，选择了第440-640位氨基酸片段；α毒素选择了C端第248-370位氨基酸片段；NetB选择了第2-192位氨基酸片段（使用减毒形式）；对于分子量巨大的ZmpB，选择了第1170-1355位氨基酸片段，该区域包含关键的gluzincin样催化核心 motif。这些片段通过刚性的α-螺旋 linker 肽段A(EAAAK)₄A连接，构成了分子量约为77 kDa的QV蛋白。

Structural modelling of the QV-protein with rigid linkers

利用AlphaFold软件对设计的QV蛋白进行了三维结构建模。结果显示，刚性linker能够使四个抗原片段在空间上有效分离，彼此间相互作用最小，且各片段的构象与其在天然蛋白中的相应部分相似，预示着这些表位能够被良好地暴露并可能具有免疫原性。

The QV-protein-vaccinated chickens produced antibodies that bound to each of the individual component antigens

Western blot分析表明，QV蛋白疫苗接种组鸡的血清能够识别QV蛋白本身以及NetB、α毒素、CnaA和ZmpB这四种单一重组蛋白，证明了QV蛋白能够诱导针对所有四个靶点的抗体反应。而单独接种各单一抗原的组，其血清主要识别对应的抗原和QV蛋白。有趣的是，NetB单独接种组的血清在ELISA中未能有效识别QV蛋白，但QV蛋白接种组的血清却能识别NetB蛋白，这可能与不同检测条件下蛋白折叠状态的差异有关。ELISA定量分析进一步证实，QV蛋白诱导了最高水平的针对其自身的血清IgY抗体反应，并且这些抗体也能显著识别各个单一抗原。

The QV-protein vaccine protected chickens from the development of NE lesions in the small intestine

攻毒保护试验是评估疫苗效力的关键。肠道病变评分显示，与未接种疫苗的对照组相比，接种QV蛋白的鸡群肠道病变评分显著降低（p < 0.05）。相比之下，单独接种任何一种单一抗原（NetB、α毒素、CnaA或ZmpB）的组均未显示出显著的保护效果。为了更全面地评估疾病严重程度，研究者还提出了一个新的综合指标——群体病变评分（Group Lesion Score, GLS），该指标综合考虑了平均病变分数和发病动物数量。计算结果显示，QV疫苗接种组的GLS相较于未处理对照组降低了96%，相较于佐剂对照组降低了94%（按传统平均病变分数计算，保护率分别为80%和77%），凸显了QV蛋白疫苗卓越的保护效力。

本研究得出结论，通过合理的生物信息学设计和结构建模，成功构建了一种包含NetB、α毒素、CnaA和ZmpB抗原片段的四价融合蛋白（QV-protein）。实验证明，该QV蛋白作为亚单位疫苗，能够诱导针对所有四种靶点的强大抗体反应，并在急性坏死性肠炎攻毒模型中为肉鸡提供了显著的保护，显著降低了肠道病变的发生率和严重程度。相比之下，针对单一毒力因子的疫苗未能提供有效保护，这有力地支持了针对NE需要多靶点免疫策略的假说。

该研究的讨论部分进一步强调了多价疫苗策略对于对抗复杂病原体如产气荚膜梭菌的重要性。研究结果不仅证实了所选抗原片段（尤其是NetB、CnaA和ZmpB，其基因敲除菌株已被证明毒力减弱）作为疫苗靶点的价值，也为后续疫苗开发指明了方向。尽管当前研究采用皮下注射方式，证明了QV蛋白的概念有效性，但讨论也指出，这种接种方式不适合大规模商业家禽养殖。未来的研究重点将转向开发更可行的疫苗递送系统，例如通过母源免疫、卵内接种或利用活细菌载体（如沙门氏菌）进行口服递送，以期激发更相关的黏膜免疫反应，从而实现低成本、高效率的群体免疫。

总之，这项研究开发的新型四价融合蛋白疫苗为控制家禽坏死性肠炎提供了一个极具前景的候选疫苗模板，对减少畜牧业对抗生素的依赖、保障动物健康和食品安全具有重要意义。