四价融合蛋白疫苗对产气荚膜梭菌诱导坏死性肠炎的免疫保护作用研究

本研究针对家禽坏死性肠炎（NE）缺乏高效疫苗的难题，设计了一种包含NetB毒素、α毒素、CnaA黏附素和ZmpB金属蛋白酶片段的新型四价（QV）融合蛋白疫苗。实验证明，该疫苗能诱导针对所有靶点的特异性抗体，并显著降低感染产气荚膜梭菌（C. perfringens）鸡群的肠道病变评分（p<0.05），为开发多靶点NE疫苗提供了关键依据。

　　

在当今全球家禽养殖业中，坏死性肠炎（Necrotic Enteritis, NE）是一种由产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）引起的严重肠道疾病，每年造成数十亿美元的经济损失。长期以来，抗生素是控制该病的主要手段，但随着抗生素耐药性问题和残留问题的日益突出，以及部分地区对抗生素使用的严格限制，开发有效的替代防控方法迫在眉睫。尽管研究人员已经鉴定出NetB毒素是产气荚膜梭菌致病的关键毒力因子，并且以此为基础开发了多种亚单位疫苗，但这些单靶点疫苗往往只能提供部分保护，效果有限。这提示我们，NE的发病机制复杂，涉及多种毒力因子协同作用，因此，针对单一靶点的免疫策略可能不足以提供全面保护。

为了解决这一难题，研究人员将目光投向了多价疫苗的开发。本研究旨在设计并评估一种新型的四价（Quadrivalent, QV）融合蛋白疫苗，该疫苗同时靶向NetB毒素、α毒素、胶原黏附素CnaA和锌金属蛋白酶ZmpB这四种关键的毒力因子。研究论文发表在《Poultry Science》上，为NE疫苗的研发提供了新的思路和实验证据。

为了开展这项研究，研究人员运用了几个关键的技术方法。首先，他们利用生物信息学工具（如IEDB、Phobius、AlphaFold）对候选毒力因子进行表位预测、结构域分析和三维结构建模，以设计QV融合蛋白。其次，通过基因合成和原核表达系统（大肠杆菌BL21）生产重组蛋白，并利用镍柱亲和层析进行纯化。研究使用了特定的动物模型（SPF级罗氏308肉鸡）进行疫苗免疫和攻毒试验，通过皮下接种疫苗，并使用高蛋白饲料和产气荚膜梭菌强毒株WER-NE36进行攻毒以诱导NE。最后，通过肠道病变评分、蛋白质印迹（Western Blot）和酶联免疫吸附试验（ELISA）来评估疫苗的免疫保护效果和抗体反应。

Epitope Prediction of Individual and QV Vaccine Candidates

研究人员首先通过生物信息学分析，为用于单个抗原和QV融合蛋白的各个毒力因子蛋白片段选定了合适的区域。为了确保重组蛋白能够高效表达，他们去除了预测的信号肽和跨膜结构域。对于QV疫苗候选分子，他们选取了每个蛋白中较小的、包含预测抗原表位的片段：NetB_2-193、CnaA_440-640、α毒素_248-370和ZmpB_1170-1355。这些片段通过一个刚性的α螺旋接头肽A(EAAAK)₄A连接，构成了分子量约为77 kDa的QV融合蛋白。

Structural modelling of the QV-protein with rigid linkers

利用AlphaFold进行的三维结构建模结果显示，刚性接头使得QV蛋白中的四个毒力因子片段在空间上相互分离，彼此间几乎没有相互作用，并且没有隐藏抗原表位。这表明，设计的QV蛋白很可能以类似于天然蛋白构象的方式展示所选的抗原表位，从而具有良好的免疫原性潜力。

The QV-protein-vaccinated chickens produced antibodies that bound to each of the individual component antigens

免疫血清的分析结果验证了QV疫苗的免疫效果。蛋白质印迹实验表明，接种QV蛋白的鸡群血清能够识别QV蛋白本身以及所有四种单个的重组蛋白（NetB、CnaA、α毒素、ZmpB）。而接种单个抗原（如NetB、α毒素等）的鸡群血清主要识别其对应的抗原和QV蛋白，但也观察到一些意外的交叉反应，例如接种Zmp或CnaA抗原的血清弱结合了α毒素等，进一步实验证实这部分交叉反应可能与重组蛋白携带的聚组氨酸标签有关。ELISA结果进一步定量证实，QV蛋白疫苗接种组针对QV蛋白的IgY抗体反应水平显著高于其他各组。值得注意的是，虽然NetB疫苗接种组的血清在Western Blot中能识别QV蛋白，但在ELISA中却未显示出显著反应；相反，QV蛋白疫苗接种组的血清却能高效识别NetB蛋白。这表明抗原在不同检测条件下的构象可能影响抗体的识别。

The QV-protein vaccine protected chickens from the development of NE lesions in the small intestine

攻毒保护试验是评估疫苗效力的关键。结果表明，与未接种疫苗的对照组相比，接种QV蛋白疫苗的鸡群肠道坏死性病变评分显著降低（p < 0.05）。研究人员还提出了一种新的综合评价指标——群体病变评分（Group Lesion Score, GLS），该指标综合考虑了病变的平均严重程度和发病动物数量。计算显示，QV蛋白疫苗接种组的GLS相较于未处理对照组降低了96%，相较于佐剂对照组降低了94%。而单独接种任何一种单一抗原（NetB、α毒素、CnaA或Zmp）的疫苗均未能提供显著的保护作用。这有力地证明了多价疫苗策略在抵抗NE方面的优越性。

综上所述，本研究成功地设计并验证了一种针对家禽坏死性肠炎的四价融合蛋白疫苗。研究结论表明，这种同时靶向NetB、α毒素、CnaA黏附素和ZmpB金属蛋白酶四种关键毒力因子的QV融合蛋白，能够诱导产生针对所有靶点的特异性抗体反应，并在攻毒实验中显著减轻鸡只的肠道病变，显示出良好的免疫保护效果。相比之下，单一抗原疫苗未能提供有效保护，这支持了针对多毒力因子的免疫策略对于控制复杂病原体感染的必要性。

在讨论部分，作者强调了多价疫苗是应对NE挑战的有效策略。本研究采用的QV蛋白设计，通过生物信息学指导的片段选择和刚性接头连接，实现了单个重组蛋白同时呈现多个抗原表位，这为后续开发更适合大规模应用的疫苗递送系统（如活菌载体、口服疫苗等）奠定了基础。虽然当前研究采用的是注射接种方式，不适合商业化家禽生产，但该QV蛋白抗原本身为开发低成本、易于接种的下一代疫苗提供了核心候选分子。此外，研究结果也提示，未来需要进一步探究NE保护性免疫的具体机制（如黏膜免疫、细胞免疫的作用），并评估疫苗在商品鸡整个生长周期内的保护效力。总之，该研究为开发高效、安全的坏死性肠炎商业疫苗迈出了重要的一步，对减少畜牧业抗生素使用、保障动物健康和食品安全具有重要意义。