四价融合蛋白疫苗通过多靶点免疫策略显著降低鸡坏死性肠炎病变

本研究针对困扰家禽业的坏死性肠炎（NE）防控难题，开发了一种包含NetB、α-毒素、CnaA黏附素和锌金属蛋白酶（Zmp）片段的新型四价（QV）融合蛋白疫苗。皮下免疫试验表明，该QV蛋白能诱导针对所有四种靶点的特异性抗体，并显著降低致病性产气荚膜梭菌攻击后鸡只的肠道病变评分（p < 0.05），为开发高效NE亚单位疫苗奠定了基础。

　　

在集约化家禽养殖中，一种名为坏死性肠炎（Necrotic Enteritis, NE）的疾病如同隐形杀手，给全球肉鸡产业造成巨大的经济损失。这种疾病的元凶是产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens），一种常见的环境细菌。长期以来，养殖场依赖抗生素来预防和控制NE的爆发。然而，随着抗生素耐药性问题的日益严峻、人们对肉类中抗生素残留的担忧，以及部分地区对抗生素使用的严格限制，寻找安全有效的替代方案迫在眉睫。疫苗被寄予厚望，但研发之路并非一帆风顺。早期研究聚焦于单个关键毒力因子，如NetB毒素（坏死性肠炎毒素B，被确认为主要毒力因子）或α-毒素（Alpha-toxin）作为亚单位疫苗，虽然能诱导部分保护，但效果始终不尽如人意。这提示我们，NE的发病机制非常复杂，单靠攻击一个靶点可能不足以制服这个“多面手”病原体。越来越多的证据表明，除了NetB之外，细菌的黏附能力（如通过CnaA黏附素结合肠道胶原蛋白）和破坏组织的能力（如通过锌金属蛋白酶Zmp）等次级毒力因子也在疾病发生中扮演重要角色。因此，科学家们将目光投向了多价疫苗——一种能够同时激发针对多个关键靶点免疫反应的“组合拳”策略。在此背景下，一项发表在《Poultry Science》上的研究报道了一种创新性的四价（QV）融合蛋白疫苗，旨在为防控鸡坏死性肠炎提供更有效的解决方案。

为了评估多靶点疫苗的潜力，研究人员主要运用了以下几项关键技术：首先，他们利用生物信息学工具（如IEDB免疫表位数据库、Phobius、AlphaFold人工智能蛋白质结构预测模型）精心筛选抗原片段并进行蛋白质结构建模，设计了由刚性螺旋连接肽A(EAAAK)₄A连接的四价融合蛋白（QV-protein）。其次，采用原核表达系统（大肠杆菌BL21(DE3)）进行重组蛋白的制备与纯化。接着，他们建立了标准的鸡坏死性肠炎攻毒模型，使用高致病性的产气荚膜梭菌澳大利亚分离株WER-NE36（netB⁺ tpeL^-）通过拌料方式感染鸡只。最后，通过肠道病变评分（评估疾病严重程度）、蛋白质印迹（Western Blot）和酶联免疫吸附测定（ELISA）等技术系统评估了疫苗诱导的免疫应答和保护效果。

Epitope Prediction of Individual and QV Vaccine Candidates

研究人员首先基于文献回顾和前期实验证据，选定了四个关键毒力因子作为疫苗候选靶点：主要毒力因子NetB，以及次级毒力因子α-毒素、胶原黏附素CnaA和锌金属蛋白酶ZmpB。为了确保重组蛋白的高效表达和免疫原性，他们利用生物信息学方法去除了预测的信号肽和跨膜结构域，并为每个蛋白选定了包含关键抗原表位的片段。对于四价疫苗（QV-protein），他们进一步精选了更小的片段：NetB_2-193（减毒形式）、CnaA_440-640、α-毒素_248-370和ZmpB_1170-1355。这些片段通过刚性α-螺旋连接肽A(EAAAK)₄A串联，形成一个单一的多价融合蛋白。

Structural modelling of the QV-protein with rigid linkers

利用AlphaFold进行蛋白质结构建模的结果显示，刚性连接肽成功地将四个抗原片段在空间上分离开来，限制了它们之间的相互作用，并且没有隐藏关键的疫苗表位。模型预测表明，QV-protein中的各个抗原片段能够以类似于其天然蛋白中相应部分的构象进行折叠，从而有望被免疫系统有效识别。

The QV-protein-vaccinated chickens produced antibodies that bound to each of the individual component antigens

免疫学研究结果证实了QV蛋白设计的成功。蛋白质印迹分析显示，接种QV-protein的鸡产生的血清抗体能够特异性识别完整的QV-protein以及NetB、α-毒素、CnaA和ZmpB这四种单独的组分蛋白。ELISA结果进一步定量验证了这一发现：QV-protein免疫组鸡只血清对所有四种靶点蛋白均产生了高水平的特异性IgY抗体应答。值得注意的是，虽然单独接种NetB蛋白的鸡血清在Western Blot中能识别NetB，但在以QV-protein为包被抗原的ELISA中反应较弱，这可能与不同检测条件下蛋白质的折叠状态差异有关。相反，QV-protein免疫诱导的抗体却能高效识别单独的NetB蛋白。此外，研究还发现，接种个别单一抗原（如Zmp或CnaA）的鸡血清对其它重组蛋白（如α-毒素）有微弱的交叉反应，后续实验证实这部分是由于对重组蛋白C端融合的polyHis标签产生了较弱的免疫反应所致。

The QV-protein vaccine protected chickens from the development of NE lesions in the small intestine

最关键的评估在于疫苗的实际保护效果。在攻毒试验后，对鸡只小肠进行病变评分。结果显示，与未接种疫苗的对照组相比，接种QV-protein的鸡只肠道病变评分显著降低（p < 0.05）。研究人员还提出了一种新的综合评价指标——群体病变评分（Group Lesion Score, GLS），该指标综合了病变平均严重程度和发病鸡只数量。计算发现，QV-protein免疫组的GLS相较于未处理对照组降低了96%，相较于佐剂对照组降低了94%。这表明QV-protein疫苗能有效保护鸡只免受产气荚膜梭菌攻击引起的严重肠道损伤。相比之下，单独接种任何一种单一抗原（NetB、α-毒素、CnaA或Zmp）的疫苗均未能提供显著的保护作用。

讨论与结论

本研究的结果有力地支持了针对坏死性肠炎（NE）采用多价疫苗策略的必要性和有效性。将四个经过精心挑选的毒力因子片段整合到一个融合蛋白中，成功诱导了针对所有靶点的广谱抗体反应，并提供了显著优于任何单一抗原疫苗的保护效果。这凸显了在应对像产气荚膜梭菌这样拥有多重毒力机制的病原体时，免疫系统需要同时应对多个关键环节才能有效遏制疾病。

尽管通过皮下注射QV-protein证明了其概念的有效性，但作者也指出，这种接种方式对于大规模商业化家禽生产而言成本过高，不具可行性。因此，未来的研究方向将聚焦于开发更经济、便捷的疫苗递送系统，例如利用活的细菌载体（如减毒沙门氏菌）通过口服途径递送QV-protein抗原。这种方式不仅能降低接种成本，还能更好地刺激肠道黏膜免疫，可能产生更理想的保护效果。此外，研究也提示，除了已选用的四个靶点，其他已被证明具有疫苗潜力的毒力因子（如ArcB, TmpC等）未来也可以考虑纳入更复杂的多价设计中以进一步提升效力。

总之，这项研究成功设计并验证了一种新型四价融合蛋白疫苗，它通过激发针对产气荚膜梭菌多个关键毒力因子的协同免疫应答，为开发高效、实用的鸡坏死性肠炎疫苗提供了强有力的候选抗原和重要的理论依据。这项成果标志着向最终控制这一重要家禽疾病迈出了关键一步。