RAS通路抑制剂联合靶向药物在多种癌症类型KRAS变异患者来源肿瘤球体中的活性研究

本文系统评估了KRAS G12C直接抑制剂sotorasib、SHP2抑制剂batoprotafib和SOS1抑制剂BI-3406分别与16种靶向药物在19种患者来源多细胞肿瘤球体模型中的联合疗效。研究通过高通量筛选发现，上游信号分子（SHP2/SOS1）与下游通路抑制剂（MEK/ERK）的垂直联合，以及RAS通路与PI3K/AKT/mTOR通路或BCL-2的双重抑制策略，在KRAS变异肿瘤模型中展现出显著的协同抗肿瘤活性，为临床联合治疗方案提供了重要 preclinical 依据。

　　

Abstract

KRAS基因是癌症中最常发生变异的致癌基因之一，而KRAS蛋白长期以来被认为不可成药。近年来针对致癌KRAS的策略包括直接抑制KRAS蛋白和通过靶向上游及下游信号通路介质间接抑制其活性。本研究设计了多细胞类型肿瘤球体的高通量筛选，以确定靶向小分子与KRAS通路抑制剂的活性组合。通过测试非受体蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2抑制剂和鸟嘌呤核苷酸交换因子SOS1抑制剂来评估间接上游通路抑制效果，而sotorasib直接抑制KRAS G12C变异体。作为单药，sotorasib和SHP2抑制剂batoprotafib对携带KRAS G12C的球体表现出选择性，而SOS1抑制剂BI-3406在不同KRAS变异体中显示出不同的活性。通过靶向SHP2或SOS1以及下游激酶MEK（trametinib）或ERK（temuterkib）对RAS/MEK/ERK通路进行垂直抑制非常有效。使用nintedanib抑制上游酪氨酸受体激酶，与batoprotafib或BI-3406联合使用也有效，并且与sotorasib联合在携带KRAS G12C的球体中显示出协同作用。通过batoprotafib或sotorasib与mTORC1/2抑制剂sapanisertib或AKT抑制剂ipatasertib联合，对RAS/MEK/ERK和PI3K/AKT/mTOR通路进行双重抑制，主要在携带KRAS G12C的球体中显示出组合活性。BCL-2抑制剂venetoclax与sotorasib、batoprotafib或BI-3406联合使用导致相加和协同的细胞毒性。最后，sotorasib和batoprotafib同时抑制KRAS通路在含有KRAS G12C的球体中显示出组合活性。

意义：KRAS变异体是一系列人类癌症的致癌驱动因素。本研究筛选了多种靶向RAS信号的小分子药物组合，并降低了来自各种人类实体瘤的多细胞类型肿瘤球体的活力。确定了值得进一步测试的组合方案。

Introduction

RAS蛋白是一小GTP水解酶（GTPases）家族。其中，KRAS是人类癌症中经常发生改变的致癌基因，并与高死亡率癌症类型相关，包括胰腺导管腺癌（PDAC）、非小细胞肺癌（NSCLC）和结直肠癌。作为GTP酶，KRAS通过在其活性GTP结合和非活性GDP结合结构之间充当二元开关来调节信号转导。KRAS信号传导由鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）和GTP酶激活蛋白（GAP）介导。G12、G13和Q61残基的功能获得性变异由于核苷酸交换速率增加和/或GAP相互作用受损而增强GTP结合，并促进肿瘤发生。KRAS介导来自生长因子受体（如EGFR）的上游信号至下游信号通路，包括MAPK信号通路、PI3K/AKT/mTOR通路和RalGEF/Ral通路。

数十年来，RAS蛋白被认为是“不可成药”的，由于其在早期晶体结构中尺寸小且明显缺乏变构结合口袋，RAS一直是一个具有挑战性的药物靶点。此外，RAS对GDP和GTP都具有皮摩尔亲和力，这给开发竞争性抑制剂带来了挑战，因为细胞内GTP和GDP浓度在微摩尔范围内。靶向KRAS变异体G12C的能力是在发现靠近开关区且邻近异常半胱氨酸残基的新口袋之后实现的。这一发现使得能够开发选择性抑制剂，这些抑制剂共价结合反应性半胱氨酸残基以稳定非活性GDP结合结构并损害与Raf的相互作用。此外，还报道了GDP的类似物可共价结合并选择性抑制KRAS G12C。

在KRAS G12C表面发现疏水switch-II凹槽使得先导化合物MRTX1257以及临床候选药物MRTX849和AMG 510的开发成为可能。Sotorasib（AMG 510）是首个进入临床试验的KRAS G12C抑制剂，它在来自经过大量预处理的患者的携带KRAS G12C变异体的实体瘤中显示出活性。长期临床研究证明了sotorasib在携带KRAS G12C的经过预处理的晚期NSCLC患者中的安全性和持久疗效，并且与标准护理多西他赛相比，sotorasib显著提高了无进展生存期。2021年，FDA加速批准sotorasib用于治疗患有KRAS G12C的局部晚期或转移性NSCLC成人患者。Sotorasib，无论是单独使用还是与其他疗法联合，目前仍在进行临床试验。

作为直接抑制KRAS的替代方案，几种抑制RAS上游因子的药物已进入临床试验，因此可能不受RAS状态的影响。GEF SOS1是RAS激活所必需的，SOS1的Cdc25结构域结合GDP结合的RAS，催化GDP与GTP的交换。SOS1还在Ras交换器 motif 结构域的一个变构位点与GTP结合的RAS相互作用，以稳定SOS1活性位点并增强其GEF功能，从而促进催化活性增加。SOS1的结构和功能研究使得能够开发多种SOS1抑制剂，包括BAY-293，它结合Cdc25结构域的疏水口袋并破坏RAS和SOS1之间的相互作用。SOS1抑制剂BI-3406也结合Cdc25疏水口袋，并与先前的化合物相比显示出改进的效力和选择性。将表达KRAS变异体的细胞系暴露于BI-3406导致GTP结合的KRAS和pERK水平快速降低，与生长抑制相关。BI-3406的类似物BI 1701963正在晚期实体瘤（携带KRAS变异）患者中进行临床试验，既作为单药治疗，也与包括伊立替康、KRAS G12C抑制剂adagrasib、sotorasib或BI 1823911以及MEK抑制剂trametinib或BI 3011441在内的药物联合使用。

生物信号级联的起始、传播和终止受蛋白酪氨酸激酶和蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）调节。SHP2是一种非受体PTP，被招募到活化的受体酪氨酸激酶（RTK）并调节信号传导。SHP2通过RAS/MEK/ERK信号通路激活涉及几种RAS负调节因子（包括p120-RasGAP和SPRY/Sprouty）的去磷酸化以增加GTP结合的RAS。此外，SHP2介导的RAS在Y32位点的去磷酸化使得能够与Raf结合。SHP2 PTP催化结构域的抑制剂已被开发，其中几种正在进行临床试验；然而，由于效力、选择性、渗透性和生物利用度有限，此类抑制剂的开发一直具有挑战性。诺华公司通过高通量筛选发现了第一个变构SHP2抑制剂SHP836，它结合在PTP催化结构域、N末端SH2结构域和C末端SH2结构域界面的中央隧道中，以稳定SHP2的自抑制构象。通过药物化学优化将SHP836优化为SHP099，效力提高了70倍以上，并改善了选择性和口服生物利用度。最终，这项工作使得能够发现首个同类SHP2抑制剂batoprotafib（TNO155），它正在进行单独使用和联合使用的临床试验，包括与KRAS G12C抑制剂如sotorasib、adagrasib或JDQ443联合。

基于RAS通路在细胞功能中的关键作用以及KRAS变异癌症中广泛的反馈再激活，全面阻断信号转导对于抗癌活性至关重要。因此，本研究评估了KRAS G12C抑制剂sotorasib，以及间接KRAS抑制剂BI-3406和batoprotafib，分别与16种FDA批准的和研究中的抗癌药物联合使用。非临床化合物MRTX1257（一种KRAS G12C抑制剂）和BAY-293（一种KRAS-SOS1相互作用抑制剂）也进行了测试，以提供不影响本研究结论的确认性数据，这些数据可从PubChem BioAssay公共数据库获得。单药和组合在多细胞类型肿瘤球体中进行测试，这些球体作为人类实体瘤的模型，包含恶性细胞、内皮细胞和间充质干细胞。这些球体来自19个恶性细胞系，包括来自NCI患者来源模型库（NCI PDMR）的患者来源细胞系和已建立的NSCLC细胞系HOP-62。这些恶性细胞系来源于以KRAS改变高频率为特征的癌症，包括结直肠癌、NSCLC和胰腺癌。

Materials and Methods

Compounds

药物和研究药物BI-3406、BAY-293、batoprotafib（TNO155）、sotorasib（AMG 510）、MRTX1257等从NCI Developmental Therapeutics Program Chemical Repository获得。所有药物和研究药物在本研究中均被证明纯度>95%。储备溶液在DMSO中制备，浓度为测试浓度的400倍，并在使用前储存在-70°C。所有药物和研究药物均在从接近临床C_max的高浓度开始，以半对数增量递减的范围内进行测试。如果尚未确定某药物的临床C_max，则测试的最高浓度为10 μmol/L。

Cell lines

患者来源癌症（PDC）细胞系来自NCI PDMR。已建立的细胞系HOP-62由NCI与约翰霍普金斯大学医学院合作开发。汇合供体人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和人间充质干细胞（hMSC）从Lonza购买。

Cell culture

所有细胞在37°C、5% CO₂和95%湿度的培养箱中维持。PDC系根据NCI PDMR建立的标准操作程序进行培养。HOP-62细胞系在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养。HUVEC在内皮细胞生长培养基2中培养，hMSC在间充质干细胞生长培养基2中培养。所有实验中，HUVEC和hMSC使用传代次数≤5的细胞，而恶性细胞系使用传代次数≤15的细胞。定期收集所有细胞系的样本，通过短串联重复谱分析和支原体检测以确认其完整性。

High-throughput drug combination screening

在多细胞类型肿瘤球体形成前，使用胰酶消化恶性细胞、HUVEC和hMSC，离心收集。多细胞类型肿瘤球体由三种细胞类型的混合物生长而成：60%恶性细胞、25% HUVEC和15% hMSC。将细胞悬液分装到384孔黑色/透明圆底超低吸附（ULA）球体微孔板中。接种后，将微孔板转移至培养箱。接种三天后，将测试药物或对照物递送至微孔板的孔中。所有抗癌药物及其组合均以四重复进行测试。此外，每个微孔板包括DMSO载体对照和细胞毒性对照。递送测试药物和对照物后，将微孔板返回培养箱培养7天。接种十天后，通过向每个孔中加入CellTiter-Glo 3D来完成测定。使用酶标仪测量发光作为细胞活力的替代指标。

Analysis of viability data

屏幕的发光测量值被导出为逗号分隔值文件并导入自定义Excel电子表格进行分析。将原始发光数据进行质量控制评估，过滤异常值，并通过归一化至DMSO（载体处理）对照转换为活力百分比。使用Excel中的Solver Add-in将浓度-反应数据拟合到四参数逻辑方程。

Analysis of combination effects

使用Bliss独立性模型评估同时联合用药的效果。在该模型中，将观察到的组合反应与根据每个单独药物的实验确定反应计算得出的预测组合反应进行比较。接近零的Bliss独立性得分表示相加效应，其中观察到的反应与预测结果密切匹配。正的Bliss独立性得分表明暴露于组合后的细胞活力低于预期，显示出大于相加的细胞毒性或协同作用。负的Bliss独立性得分，其中观察到的细胞活力大于预期，表明小于相加的细胞毒性或拮抗作用。

Volume under the viability surface

为了量化整体药物组合反应，使用浓度-反应矩阵计算活力表面下的体积（VUS）。为了能够在不同浓度范围内测试的药物对之间进行直接比较，通过将浓度值标准化为浓度水平之间的相等间距而不是使用绝对浓度来进行分析。VUS是通过对矩阵中所有浓度点的活力值进行数值积分来计算的，提供了总反应表面面积的估计。较低的VUS值表示较大的整体细胞毒性，而较高的值反映较弱的药物活性。所有VUS值在0到1的范围内标准化，其中1代表所有组合矩阵中观察到的最高活力。

Results

为了模拟肿瘤微环境并促进细胞间相互作用，我们采用了一种适用于高通量筛选的体外多细胞类型肿瘤球体模型。该人类实体瘤模型包含人类恶性细胞、HUVEC和hMSC。除了含有KRAS G12C的成熟HOP-62细胞系外，还评估了18个具有一系列KRAS变异体的患者来源恶性细胞系。在研究药物组合之前，评估了单个药物在所有肿瘤球体模型中的细胞毒性。sotorasib、batoprotafib和BI-3406在19个多细胞类型肿瘤球体模型中的浓度依赖性反应如图所示。Sotorasib在组合研究选择的浓度范围内表现出相对均匀的反应，这些浓度选择与临床C_max一致，并提供与患者可达到浓度相关的数据。为了评估sotorasib的完全敏感性范围，在所有模型中进行了九个浓度（1 nmol/L–10 μmol/L）的初步实验。sotorasib和batoprotafib都对携带KRAS G12C的肿瘤球体表现出一定程度的选择性，如标准化AUC热图所示。在KRAS G12C模型中，基于AUC值观察到sotorasib与SHP2抑制剂batoprotafib之间，以及MEK抑制剂trametinib与ERK抑制剂temuterkib之间存在一些相关性。然而，鉴于本研究中KRAS G12C模型数量有限（n = 5），只有trametinib和temuterkib之间的相关性达到统计学显著性。总结这些关系的Pearson相关矩阵如图所示。未观察到细胞系倍增时间与其对sotorasib敏感性之间的相关性。相比之下，BI-3406没有表现出明显的选择性，并在大约一半测试的肿瘤球体中达到IC₅₀。所有携带KRAS G12C的肿瘤球体模型在浓度低于100 nmol/L时对sotorasib表现出浓度依赖性反应；然而，细胞毒性的深度各不相同。最敏感模型941728-121-R-J1显示KRAS杂合性缺失以及拷贝数扩增。尽管未包括在本研究中，作为多细胞类型肿瘤球体生长的胰腺癌细胞系MIA PaCa-2对sotorasib显示出强烈的浓度依赖性反应。在整个浓度范围内，未观察到HUVEC和hMSC对sotorasib的细胞毒性反应，这可能是多细胞类型肿瘤球体与仅由MIA PaCa-2细胞生长的球体相比观察到的细胞毒性降低的原因。与单层细胞相比，3D球体观察到 substantially more 细胞毒性，这与先前在携带KRAS G12C的细胞系中研究KRAS G12C靶向药物的结果一致。在与sotorasib联合测试的七种药物中，除了trametinib、temuterkib、nintedanib和venetoclax的最高浓度外，HUVEC和hMSC的总体细胞毒性有限。

直接靶向KRAS G12C的sotorasib与RAS/MEK/ERK通路的下游组分（包括trametinib或temuterkib）联合使用，导致最小的相加效应或无显著的组合反应。显示了五个携带KRAS G12C变异体的肿瘤球体模型中的四个，以及一个具有野生型KRAS和BRAF V600E变异体的NSCLC模型的浓度-反应图和Bliss独立性热图。任何观察到的相加效应在所有sotorasib浓度下都是一致的，反映了在测试浓度范围内相对平坦的单药反应。使用多靶点RTK抑制剂nintedanib（靶向FGFR1-3、PDGFR α/β和VEGFR1-3）抑制KRAS通路中的上游受体，与sotorasib联合使用，在携带KRAS G12C的肿瘤球体模型中产生了组合效应。值得注意的是，胰腺模型323965-272-R-J2和子宫癌肉瘤模型327498-153-R-J2表现出一些协同作用。出乎意料的是，sotorasib对具有野生型KRAS的349418-098-R模型和具有KRAS G12D的292921-168-R-J2模型显示出单药活性，在10 μmol/L时细胞活力<50%。五个携带KRAS G12C的模型在浓度低于100 nmol/L时均表现出对sotorasib的浓度依赖性细胞活力降低，而349418-098-R和292921-168-R-J2模型在高于1 μmol/L时表现出敏感性。因此，观察到的这两个模型的反应可能归因于脱靶活性。来自NCI PDMR PDC细胞系的关键信号蛋白的变异状态和基因拷贝数如图所示。

双重靶向KRAS G12C和PI3K/AKT/mTOR通路代表了另一种潜在的治疗策略。Sotorasib与mTORC1/2抑制剂sapanisertib或AKT抑制剂ipatasertib的组合在含有G12C变异体的球体中表现出相似的相加效应，在NSCLC HOP-62模型中协同作用最大。鉴于凋亡调控在KRAS驱动肿瘤中的作用，我们还探索了sotorasib与BCL-2抑制剂venetoclax的组合。该组合主要在携带KRAS G12C变异体的球体中导致相加反应。与先前的组合一样，任何观察到的效应在所有sotorasib浓度下基本保持一致。

间接靶向KRAS与SHP2或SOS1抑制剂以及RAS/MEK/ERK通路的下游组分被证明是体外最有效的策略之一。这从batoprotafib与trametinib或temuterkib的组合中显而易见。图显示了选定的多细胞类型肿瘤球体模型的浓度-反应图和Bliss独立性热图，而所有模型的数据显示在补充图中。batoprotafib与trametinib或temuterkib组合的平均Bliss得分表明，在相同肿瘤模型中可见相当水平的相加或协同效应。BI-3406与trametinib或temuterkib组合也观察到类似的结果。图显示了选定的多细胞类型肿瘤球体模型的浓度-反应图和Bliss独立性热图，而所有模型的数据显示在补充图中。BI-3406与trametinib或temuterkib组合的平均Bliss得分之间存在较弱但具有统计学显著性的相关性。有趣的是，计算得出batoprotafib或BI-3406与trametinib组合的平均Bliss得分之间存在统计学显著相关性，或者与temuterkib组合的平均Bliss得分之间存在统计学显著相关性，这可能归因于batoprotafib和BI-3406干扰RAS信号通路的共享点。或者，nintedanib的上游RTK抑制与batoprotafib和BI-3406联合在多个肿瘤球体模型中也导致相加和协同效应。这些效应在每种联合药物的较高浓度下是明显的。图显示了选定的多细胞类型肿瘤球体模型的浓度-反应图和Bliss独立性热图，而所有模型的数据显示在补充图中。值得注意的是，nintedanib与batoprotafib或BI-3406的组合对具有一系列KRAS变异体的细胞系有效。与trametinib或temuterkib的组合类似，它们对具有野生型KRAS和BRAF V600E变异体的NSCLC模型活性有限。

用sapanisertib靶向PI3K/AKT/mTOR通路与batoprotafib联合在五个具有KRAS G12C变异体的模型中显示出相加和协同活性（其中四个显示在图7A中），而在具有野生型KRAS和BRAF V600E变异体的NSCLC模型中未观察到组合活性。尽管大多数没有KRAS G12C变异体的模型对batoprotafib和sapanisertib的组合反应最小，但在具有KRAS G12D变异体的患者来源结肠模型186277-243-T-J2中观察到协同作用。同样，batoprotafib和ipatasertib的组合产生了与sapanisertib相似的相加或协同活性，显示出对具有KRAS G12C变异体的模型和186277-243-T-J2模型的选择性活性。总体而言，sapanisertib或ipatasertib与BI-3406的组合相比它们与batoprotafib的组合选择性和有效性较差。

venetoclax与batoprotafib或BI-3406的组合也在各种球体模型中观察到显著的组合活性。大于相加的反应主要在每种药物的较高浓度下观察到。这些组合在大多数KRAS变异体中表现出相加和协同活性，但对具有野生型KRAS和BRAF V600E的349418-098-R NSCLC模型影响有限。最后，sotorasib和batoprotafib同时抑制KRAS通路在携带KRAS G12C变异体的球体中导致相加和协同活性。在多细胞类型肿瘤球体含有HOP-62 NSCLC细胞系中观察到最大的协同作用，实现了高达一个数量级的细胞毒性。相加效应在患者来源的NSCLC模型LG0567-F671中导致近99%的细胞毒性（两个数量级的减少）。

为了研究19个多细胞类型肿瘤球体对RAS通路抑制剂组合的反应的潜在模式，进行了主成分分析。分析数据结合了细胞活力信息和来自Bliss独立性模型的组合活性。为了总结肿瘤球体模型在整个药物组合浓度矩阵中的细胞活力，计算了VUS值。通过从整个药物组合矩阵计算的平均Bliss得分描述了从肿瘤球体模型观察到的整体组合效应。尽管分析揭示了基于其体外反应的四个不同的肿瘤球体模型簇，但未发现KRAS状态与对各种组合的敏感性之间存在明显的关系。

Discussion

KRAS被广泛认为是癌症中最常改变的致癌基因之一。最近对癌症基因组图谱数据库的分析表明，KRAS变异存在于近12%的所有癌症中，其中PDAC的患病率最高，超过80%，其次是结直肠癌，近40%，NSCLC患者中约为20%。FDA里程碑式地批准sotorasib用于治疗携带KRAS G12C的NSCLC，证明了精确靶向恶性细胞可以带来治疗益处。大约一年后，KRAS G12C抑制剂adagrasib获得了FDA针对相同适应症的加速批准。一系列额外的KRAS G12C抑制剂正在开发中，包括olomorasib (LY3537982)、divarasib (GDC-6036)、garsorasib (D-1553)、HBI-2438、opnurasib (JDQ443)、glecirasib (JAB-21822)、HS-10370、IBI351 (GFH925)、BI 1823911、JNJ-74699157、ARS-853、ARS-1620、ASP2453和ERAS-3490。针对其他KRAS变异体（包括G12D、G12S和G12R）的抑制剂也在开发中，几种G12D选择性抑制剂现已进入临床试验。除了直接靶向特定的KRAS变异体，pan-KRAS(ON)抑制剂的开发显示出有效治疗一系列癌症的前景。最近有研究指出，sotorasib不仅是KRAS G12C的有效抑制剂，也是HRAS G12C和NRAS G12C的有效抑制剂，扩大了sotorasib可能在治疗上重要的肿瘤范围和数量。尽管sotorasib治疗在目标患者群体中产生了显著反应，但未实现持久的完全反应。对携带KRAS G12C的NSCLC患者的改进治疗可能来自联合治疗方案，包括免疫疗法、放射疗法和化学疗法。

也有通过靶向RAS上游的信号传导来抑制RAS通路活性的努力。其中两项努力包括靶向SHP2和SOS1，两者都破坏RAS核苷酸交换过程。SHP2和SOS1抑制剂作为单一疗法的临床试验显示出有限的疗效，因此药物组合正在临床评估中。SHP2已被证明可调节免疫检查点并抑制抗肿瘤免疫反应。因此，几项临床试验正在评估SHP2抑制剂与免疫疗法的组合。

在本研究中，检查了变构SHP2抑制剂batoprotafib、SOS1抑制剂BI-3406和KRAS G12C等位基因特异性抑制剂sotorasib与一系列靶向小分子药物的组合。探索的组合化疗方案的潜在方法包括靶向RTKs（erdafitinib, nintedanib, cabozantinib）、丝裂原活化蛋白激酶（trametinib, temuterkib）、PI3K/AKT/mTOR信号通路中间体（ipatasertib, sapanisertib）