尼达尼布联合巴托普塔菲靶向受体酪氨酸激酶抑制在KRAS变异肿瘤中的协同治疗策略

本综述系统评价了KRAS（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog）变异肿瘤的靶向治疗策略，重点探讨了直接KRAS G12C抑制剂sotorasib（AMG 510）、SHP2（Src homology 2 domain–containing protein tyrosine phosphatase）抑制剂batoprotafib（TNO155）及SOS1（Son of Sevenless homolog 1）抑制剂BI-3406单用及与下游MEK（trametinib）、ERK（temuterkib）、PI3K/AKT（ipatasertib）/mTOR（sapanisertib）通路抑制剂、BCL-2（venetoclax）及受体酪氨酸激酶（nintedanib）联用的协同效应。通过多细胞肿瘤球体模型验证，为KRAS驱动肿瘤的联合疗法提供了 preclinical 依据。

　　

摘要

KRAS（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog）基因是人类癌症中最常发生变异的致癌基因之一，其编码的KRAS蛋白曾长期被视为“不可成药”靶点。近年来，针对致癌KRAS的治疗策略包括直接抑制KRAS蛋白本身，以及通过靶向上游和下游信号通路介质间接抑制其活性。本研究设计了一种多细胞类型肿瘤球体的高通量筛选方法，旨在识别靶向小分子与KRAS通路抑制剂的有效组合。通过测试SHP2（Src homology 2 domain–containing protein tyrosine phosphatase）抑制剂batoprotafib（TNO155）和SOS1（Son of Sevenless homolog 1）抑制剂BI-3406来评估间接上游通路抑制的效果，而sotorasib（AMG 510）则直接抑制KRAS G12C变异体。作为单药，sotorasib和batoprotafib对携带KRAS G12C的球体表现出选择性，而SOS1抑制剂BI-3406在不同KRAS变异体中显示出不同的活性。通过靶向SHP2或SOS1以及下游激酶MEK（trametinib）或ERK（temuterkib）来垂直抑制RAS（rat sarcoma virus）/MEK/ERK通路，效果显著。使用nintedanib抑制上游酪氨酸受体激酶，并与batoprotafib或BI-3406联合使用也有效，并且与sotorasib联用时，在携带KRAS G12C的球体中显示出协同作用。通过batoprotafib或sotorasib与mTORC1/2抑制剂sapanisertib或AKT抑制剂ipatasertib联用，双重抑制RAS/MEK/ERK和PI3K/AKT（Ak strain transforming）/mTOR通路，主要在携带KRAS G12C的球体中显示出组合活性。BCL-2抑制剂venetoclax与sotorasib、batoprotafib或BI-3406联用，导致相加和协同的细胞毒性。最后，sotorasib和batoprotafib同时抑制KRAS通路，在含有KRAS G12C的球体中显示出组合活性。

意义：KRAS变异体是一系列人类癌症的致癌驱动因素。本研究筛选了多种靶向RAS信号的小分子药物组合，它们能降低来自各种人类实体瘤的多细胞类型肿瘤球体的活力，并确定了值得进一步测试的组合方案。

引言

RAS（Rat sarcoma virus）蛋白是一类小GTP水解酶（Guanosine triphosphate hydrolases）。其中，KRAS是人类癌症中经常发生改变的致癌基因，与高死亡率癌症类型相关，包括胰腺导管腺癌（PDAC）、非小细胞肺癌（NSCLC）和结直肠癌。作为GTP酶，KRAS通过在其活性GTP结合和非活性GDP结合结构之间充当二元开关来调节信号转导。KRAS信号传导由鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）和GTP酶激活蛋白（GAP）介导。G12、G13和Q61残基的功能获得性变异由于核苷酸交换速率增加和/或GAP相互作用受损，增强了GTP结合，并促进肿瘤发生。KRAS介导来自生长因子受体（如EGFR）的上游信号至下游信号通路，包括MAPK信号通路、PI3K/AKT/mTOR通路和RalGEF/Ral通路。

数十年来，RAS蛋白被认为是“不可成药”的，由于其在早期晶体结构中体积小且明显缺乏变构结合口袋，RAS一直是一个具有挑战性的药物靶点。此外，RAS对GDP和GTP都具有皮摩尔级的亲和力，这给开发竞争性抑制剂带来了挑战，因为细胞内GTP和GDP的浓度在微摩尔范围。靶向KRAS G12C变异体的能力是在发现靠近开关区且邻近异常半胱氨酸残基的新口袋之后实现的。这一发现使得能够开发选择性抑制剂，这些抑制剂共价结合反应性半胱氨酸残基，以稳定非活性GDP结合结构，并损害与Raf的相互作用。此外，还报道了GDP的类似物，它们能共价结合并选择性抑制KRAS G12C。

在KRAS G12C表面发现了一个疏水的switch-II凹槽，使得先导化合物MRTX1257和临床候选药物MRTX849及AMG 510的开发成为可能。Sotorasib（AMG 510）是第一个进入临床试验的KRAS G12C抑制剂，在携带KRAS G12C变异体的经过大量预处理的患者的实体瘤中显示出活性（CodeBreaK 100，clinicaltrials.gov NCT03600883）。长期临床研究证明了sotorasib在携带KRAS G12C的经预处理晚期NSCLC患者中的安全性和持久疗效，并且与标准治疗多西他赛相比，sotorasib显著提高了无进展生存期（clinicaltrials.gov NCT04303780）。2021年，FDA加速批准sotorasib用于治疗患有KRAS G12C的局部晚期或转移性NSCLC成人患者。Sotorasib，无论是单独使用还是与其他疗法联合使用，目前仍在进行临床试验。

作为直接抑制KRAS的替代方案，几种抑制RAS上游因子的药物已进入临床试验，因此可能不受RAS状态的影响。GEF Son-of-Sevenless homolog 1（SOS1）是RAS激活所必需的，SOS1的Cdc25结构域结合GDP结合的RAS，催化GDP与GTP的交换。SOS1还在Ras交换器模体结构域的一个变构位点与GTP结合的RAS相互作用，以稳定SOS1活性位点并增强其GEF功能，从而促进催化活性增加。对SOS1的结构和功能研究使得能够开发多种SOS1抑制剂，包括BAY-293，它结合Cdc25结构域的疏水口袋并破坏RAS和SOS1之间的相互作用。SOS1抑制剂BI-3406也结合Cdc25疏水口袋，并与先前的化合物相比显示出更高的效力和选择性。将表达KRAS变异体的细胞系暴露于BI-3406会导致GTP结合的KRAS和pERK水平迅速降低，这与生长抑制相关。BI-3406的类似物BI 1701963正在晚期携带KRAS变异体的实体瘤患者中进行临床试验，既作为单药，也与包括伊立替康、KRAS G12C抑制剂adagrasib、sotorasib或BI 1823911以及MEK抑制剂trametinib或BI 3011441在内的药物联合使用。

生物信号级联的启动、传播和终止受蛋白酪氨酸激酶和蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）调节。Src homology-2（SH2）结构域包含的PTP（SHP2）是一种非受体PTP，被招募到活化的受体酪氨酸激酶（RTK）并调节信号传导。SHP2激活RAS/MEK/ERK信号通路涉及对几种RAS负调节因子（包括p120-RasGAP和SPRY/Sprouty）进行去磷酸化，以增加GTP结合的RAS。此外，SHP2介导的RAS在Y32位点的去磷酸化使得能够与Raf结合。SHP2 PTP催化结构域的抑制剂已被开发出来，其中几种正在进行临床试验；然而，由于效力、选择性、渗透性和生物利用度有限，此类抑制剂的开发一直具有挑战性。诺华公司通过高通量筛选发现了第一个变构SHP2抑制剂SHP836，它结合在PTP催化结构域、N端SH2结构域和C端SH2结构域界面处的中央隧道，以稳定SHP2的自抑制构象。通过药物化学优化将SHP836改进为SHP099，效力提高了70倍以上，并改善了选择性和口服生物利用度。最终，这项工作使得能够发现首个SHP2抑制剂batoprotafib（TNO155），它正在作为单药和联合疗法（包括与sotorasib、adagrasib或JDQ443等KRAS G12C抑制剂联合）进行临床试验。

基于RAS通路在细胞功能中的关键作用以及KRAS变异癌症中广泛的反馈再激活，全面阻断信号转导对于抗癌活性至关重要。因此，本研究评估了KRAS G12C抑制剂sotorasib，以及间接KRAS抑制剂BI-3406和batoprotafib，既作为单药，也与16种FDA批准的和研究中的抗癌药物联合使用。非临床化合物MRTX1257（一种KRAS G12C抑制剂）和BAY-293（一种KRAS-SOS1相互作用抑制剂）也进行了测试，以提供不影响本研究结论的验证性数据，这些数据可从PubChem BioAssay公共数据库获取。单药和组合在多细胞类型肿瘤球体中进行测试，这些球体作为人类实体瘤的模型，包含恶性细胞、内皮细胞和间充质干细胞。这些球体由19个恶性细胞系生长而成，包括来自NCI患者衍生模型库（NCI PDMR）的患者衍生细胞系和已建立的NSCLC细胞系HOP-62。这些恶性细胞系来源于以KRAS改变高频率为特征的癌症，包括结直肠癌、NSCLC和胰腺癌。

材料与方法

化合物

药物和研究性药物BI-3406、BAY-293、batoprotafib（TNO155）、sotorasib（AMG 510）、MRTX1257等从NCI发育治疗计划化学库获得。FDA批准的抗癌药物组可从发育治疗计划获取。本研究中使用的药物和研究性药物经质子核磁共振和LC/MS证明纯度>95%。储备溶液在DMSO中制备，浓度为测试浓度的400倍，并在使用前储存于-70°C。所有药物和研究性药物在从接近或处于临床C_max的高浓度开始，以半对数增量递减的范围内进行测试。如果某药物的临床C_max尚未确定，则测试的最高浓度为10 μmol/L。

细胞系

患者衍生癌症（PDC）细胞系来自NCI PDMR。已建立的细胞系HOP-62由NCI与约翰霍普金斯大学医学院合作开发。汇合供体人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和人间充质干细胞（hMSC）从Lonza购买。

细胞培养

类似的方法先前已在不同细胞系组的球体研究中描述过。所有细胞在37°C、5% CO₂和95%湿度的培养箱中维持。PDC系根据NCI PDMR建立的标准操作程序进行培养。简而言之，所有PDC在解冻后的前三次传代中，在包被有Matrigel的培养瓶中进行培养。所有PDC在完全DMEM/F-12培养基中培养。已建立的细胞系HOP-62在含有10%限定FBS的RPMI 1640培养基中培养。汇合供体HUVEC在内皮细胞生长培养基2中培养，hMSC在间充质干细胞生长培养基2中培养。对于所有实验，HUVEC和hMSC使用传代次数≤5的细胞，而恶性细胞系使用传代次数≤15的细胞。在整个筛选过程中定期收集所有细胞系的样本，由Labcorp进行短串联重复谱分析和支原体测试，以确认其完整性。

高通量药物组合筛选

类似的方法先前已在侧重于不同细胞系组和肿瘤学药物的球体研究中描述过。在接种到微孔板之前，使用TrypLE Express将恶性细胞、HUVEC和hMSC从培养瓶中取出，并以233 × g离心5分钟收集。去除上清液后，将细胞重悬于新鲜培养基中，并使用Cellometer auto T4明场细胞计数仪和台盼蓝对活细胞进行计数。多细胞类型肿瘤球体由三种细胞类型的混合物生长而成：60%恶性细胞、25% HUVEC和15% hMSC。将42 μL的混合细胞悬浮液分装到384孔黑色/透明圆底超低吸附（ULA）球体微孔板的孔中。细胞铺板密度见补充表。接种后，将微孔板转移至培养箱，并在37°C、5% CO₂和95%湿度下维持。接种三天后，将测试剂或对照物递送到微孔板的孔中。将制备为400× DMSO储备溶液的FDA批准和研究性抗癌药物首先在培养基中稀释50倍，然后使用Tecan Freedom EVO 200基础单元将6 μL转移至含有42 μL细胞悬浮液的微孔板的相应孔中，以达到1×最终浓度。所有抗癌药物及其组合均以四重复进行测试。此外，每个微孔板包括DMSO载体对照和细胞毒性对照。在递送测试剂和对照物后，将微孔板返回培养箱培养7天。接种十天后，通过向每个孔中加入20 μL CellTiter-Glo 3D来完成测定。接下来，将微孔板置于微孔板振荡器上振荡5分钟。在室温下孵育25分钟后，使用PHERAstar FSX微孔板读数仪测量发光，作为细胞活力的替代指标。

活力数据分析

从筛选获得的发光测量值导出为逗号分隔值文件，并导入到自定义Excel电子表格中进行分析。对原始发光数据进行质量控制评估，过滤异常值，并通过归一化到DMSO（载体处理）对照转换为活力百分比。使用Excel中的Solver插件将浓度-响应数据拟合到四参数逻辑方程。

组合效应分析

使用Bliss独立模型评估同时组合药物的效应。在该模型中，将观察到的组合响应与从每个单独药物的实验确定的响应计算得出的预测组合响应进行比较。接近零的Bliss独立评分表示相加效应，其中观察到的响应与预测结果密切匹配。正的Bliss独立评分表明暴露于组合后的细胞活力低于预期，显示出大于相加的细胞毒性或协同作用。负的Bliss独立评分，其中观察到的细胞活力大于预期，表示小于相加的细胞毒性或拮抗作用。

活力曲面下体积

为了量化整体药物组合响应，使用浓度-响应矩阵计算活力曲面下体积（VUS）。为了能够直接比较在不同浓度范围内测试的药物对，通过将浓度值归一化为浓度水平之间的等间距而不是使用绝对浓度来标准化分析。通过对矩阵中所有浓度点的活力值进行数值积分来计算VUS，从而提供总响应曲面面积的估计。较低的VUS值表示更大的整体细胞毒性，而较高的值反映较弱的药物活性。所有VUS值在0到1的范围内归一化，其中1代表所有组合矩阵中观察到的最高活力。

结果

为了模拟肿瘤微环境并促进细胞-细胞相互作用，我们采用了一种适用于高通量筛选的体外多细胞类型肿瘤球体模型。这种人类实体瘤模型包含人类恶性细胞、HUVEC和hMSC。除了已建立的携带KRAS G12C的HOP-62细胞系外，还评估了18个具有一系列KRAS变异体的患者衍生恶性细胞系。在研究药物组合之前，首先在所有肿瘤球体模型中评估了单个药物的细胞毒性。sotorasib、batoprotafib和BI-3406在19个多细胞类型肿瘤球体模型中的浓度依赖性响应如图所示。sotorasib和batoprotafib在组合研究选择的浓度范围内表现出相对均匀的响应，这些浓度选择与临床C_max一致，并提供与患者可达到浓度相关的数据。为了评估sotorasib的完全敏感性范围，在所有模型中进行了包含九个浓度（1 nmol/L–10 μmol/L）的初步实验。sotorasib和batoprotafib都表现出对携带KRAS G12C的肿瘤球体的一定程度的选择性。在KRAS G12C模型中，基于AUC值观察到sotorasib与SHP2抑制剂batoprotafib之间，以及MEK抑制剂trametinib与ERK抑制剂temuterkib之间存在一些相关性。然而，鉴于本研究中KRAS G12C模型数量有限，只有trametinib和temuterkib之间的相关性达到统计学显著性。总结这些关系的Pearson相关矩阵如图所示。未观察到细胞系倍增时间与其对sotorasib敏感性之间的相关性。相比之下，BI-3406没有表现出明显的选择性，并在大约一半测试的肿瘤球体中达到IC₅₀。所有携带KRAS G12C的肿瘤球体模型在低于100 nmol/L的浓度下对sotorasib表现出浓度依赖性响应；然而，细胞毒性的深度各不相同。最敏感的模式941728-121-R-J1显示出KRAS杂合性缺失以及拷贝数扩增。尽管未包括在本研究中，但作为多细胞类型肿瘤球体生长的胰腺癌细胞系MIA PaCa-2对sotorasib显示出强烈的浓度依赖性响应。在整个浓度范围内，未观察到HUVEC和hMSC对sotorasib的细胞毒性响应，这可能是多细胞类型肿瘤球体与仅由MIA PaCa-2细胞生长的球体相比细胞毒性降低的原因。与先前在携带KRAS G12C的细胞系中对KRAS G12C靶向药物的研究一致，在3D球体中观察到比单层培养明显更多的细胞毒性。在与sotorasib联合测试的七种药物中，除了最高浓度的trametinib、temuterkib、nintedanib和venetoclax外，对HUVEC和hMSC的总体细胞毒性有限。

直接靶向KRAS G12C的sotorasib与RAS/MEK/ERK通路的下游组分（包括trametinib或temuterkib）联合使用，导致最小的相加效应或无显著的组合响应。显示了五个携带KRAS G12C变异体的肿瘤球体模型以及一个具有野生型KRAS和BRAF V600E变异体的NSCLC模型的浓度-响应图和Bliss独立性热图。任何观察到的相加效应在所有sotorasib浓度下都是一致的，反映了在测试浓度范围内相对平坦的单药响应。使用多靶点RTK抑制剂nintedanib抑制KRAS通路中的上游受体，与sotorasib联合使用，在携带KRAS G12C的肿瘤球体模型中产生了组合效应。值得注意的是，胰腺模型323965-272-R-J2和子宫癌肉瘤模型327498-153-R-J2表现出一些协同作用。出乎意料的是，sotorasib在具有野生型KRAS的349418-098-R模型和具有KRAS G12D的292921-168-R-J2模型中显示出单药活性，在10 μmol/L时细胞活力降至50%以下。五个携带KRAS G12C的模型在低于100 nmol/L的sotorasib浓度下均表现出浓度依赖性的细胞活力降低，而349418-098-R和292921-168-R-J2模型在高于1 μmol/L时表现出敏感性。因此，观察到的这两个模型的响应可能归因于脱靶活性。来自NCI PDMR PDC细胞系的关键信号蛋白的变异状态和基因拷贝数在补充材料中显示。

双重靶向KRAS G12C和PI3K/AKT/mTOR通路代表了另一种潜在的治疗策略。sotorasib与mTORC1/2抑制剂sapanisertib或AKT抑制剂ipatasertib的组合在G12C变异体含有的球体中表现出相似的相加效应，在NSCLC HOP-62模型中协同作用最大。鉴于凋亡调节在KRAS驱动肿瘤中的作用，我们还探索了sotorasib与BCL-2抑制剂venetoclax的组合。这种组合主要在携带KRAS G12C变异体的球体中导致相加响应。与先前的组合一样，任何观察到的效应在所有sotorasib浓度上基本保持一致。

间接靶向KRAS与SHP2或SOS1抑制剂，以及RAS/MEK/ERK通路的下游组分，被证明是体外最有效的策略之一。这从batoprotafib与trametinib或temuterkib的组合中显而易见。显示了选定的多细胞类型肿瘤球体模型的浓度-响应图和Bliss独立性热图，而所有模型的数据显示在补充图中。在相同的肿瘤模型中，batoprotafib与trametinib或temuterkib组合的平均Bliss评分显示出可比水平的相加或协同效应。BI-3406与trametinib或temuterkib组合也观察到类似的结果。显示了选定的多细胞类型肿瘤球体模型的浓度-响应图和Bliss独立性热图，而所有模型的数据显示在补充图中。BI-3406与trametinib或temuterkib组合的平均Bliss评分之间存在较弱但统计学上显著的相关性。有趣的是，计算得出batoprotafib或BI-3406与trametinib组合的平均Bliss评分之间存在统计学上显著的相关性，或与temuterkib组合，这可能归因于batoprotafib和BI-3406干扰RAS信号通路的共同点。或者，nintedanib的上游RTK抑制与batoprotafib和BI-3406联合也在多个肿瘤球体模型中产生了相加和协同效应。这些效应在每个组合药物的较高浓度下是明显的。显示了选定的多细胞类型肿瘤球体模型的浓度-响应图和Bliss独立性热图，而所有模型的数据显示在补充图中。值得注意的是，nintedanib与batoprotafib或BI-3406的组合对具有一系列KRAS变异体的细胞系有效。与trametinib或temuterkib的组合类似，它们对具有野生型KRAS和BRAF V600E变异体的NSCLC模型活性有限。

双重抑制RAS/MEK/ERK和PI3K/AKT/mTOR通路是另一种潜在的治疗策略。batoprotafib与mTORC1/2抑制剂sapanisertib的组合在五个具有KRAS G12C变异体的球体中表现出相加和协同活性，而对具有野生型KRAS和BRAF V600E变异体的NSCLC模型未观察到组合活性。尽管大多数没有KRAS G12C变异体的模型对batoprotafib和sapanisertib的组合反应最小，但在具有KRAS G12D变异体的患者衍生结肠模型186277-243-T-J2中观察到协同作用。同样，batoprotafib和ipatasertib的组合产生了与sapanisertib相似的相加或协同活性，显示出对具有KRAS G12C变异体的模型和186277-243-T-J2模型的选择性活性。总体而言，sapanisertib或ipatasertib与BI-3406的组合相比它们与batoprotafib的组合选择性和有效性较差。

venetoclax与batoprotafib或BI-3406的组合也显示出显著活性。大于相加的响应主要在每种药物的较高浓度下观察到。这些组合在大多数KRAS变异体中表现出相加和协同活性，但对具有野生型KRAS和BRAF V600E的349418-098-R NSCLC模型影响有限。最后，sotorasib和batoprotafib同时抑制KRAS通路，在含有KRAS G12C变异体的球体中产生了相加和协同活性。大多数协同作用在含有HOP-62 NSCLC细胞系的多细胞类型肿瘤球体中观察到，其中实现了高达一个数量级的细胞毒性。相加效应导致患者衍生的NSCLC模型LG0567-F671中近99%的细胞毒性。

为了研究19个多细胞类型肿瘤球体对RAS通路抑制剂组合的响应潜在模式，进行了主成分分析。分析数据结合了细胞活力信息和来自Bliss独立性模型的组合活性。为了总结肿瘤球体模型在整个药物组合浓度矩阵中的细胞活力，计算了VUS值。通过从整个药物组合矩阵计算的平均Bliss评分来描述从肿瘤球体模型观察到的整体组合效应。尽管分析基于其体外响应揭示了四个不同的肿瘤球体模型簇，但未发现KRAS状态与对各种组合的敏感性之间存在明显关系。

讨论

KRAS被广泛认为是癌症中最常发生改变的致癌基因之一。最近对癌症基因组图谱数据库的分析表明，KRAS变异体存在于近12%的所有癌症中，其中胰腺导管腺癌的患病率最高，超过80%，其次是结直肠癌，近40%，NSCLC患者中约为20%。FDA里程碑式地批准sotorasib用于治疗携带KRAS G12C的NSCLC，证明了对恶性细胞的精确靶向可以带来治疗益处。大约一年后，KRAS G12C抑制剂adagrasib获得了FDA针对相同适应症的加速批准。一系列额外的KRAS G12C抑制剂目前正在开发中。针对其他KRAS变异体的抑制剂也在开发中。除了直接靶向特定KRAS变异体外，靶向全谱KRAS变异体的pan-KRAS(ON)抑制剂的开发显示出有效治疗一系列癌症的前景。最近有研究指出，sotorasib不仅是KRAS G12C的有效抑制剂，也是HRAS G12C和NRAS G12C的有效抑制剂，扩大了sotorasib可能具有治疗重要性的肿瘤范围和数量。尽管sotorasib治疗在目标患者群体中产生了显著响应，但未实现持久的完全缓解。对携带KRAS G12C的NSCLC患者的改进治疗可能来自联合治疗方案，包括免疫疗法、放射疗法和化学疗法。

也有努力通过靶向RAS上游的信号传导来抑制RAS通路活性。两个这样的努力包括靶向SHP2和SOS1，两者都破坏RAS核苷酸交换过程。作为单药治疗的SHP2和SOS1抑制剂的临床试验已证明疗效有限，因此药物组合正在临床评估中。SHP2已被证明能调节免疫检查点并抑制抗肿瘤免疫反应。因此，一些临床试验正在评估SHP2抑制剂与免疫疗法的组合。

在本研究中，检查了变构SHP2抑制剂batoprotafib、SOS1抑制剂BI-3406和KRAS G12C等位基因特异性抑制剂sotorasib与一系列靶向小分子药物的组合。探索的组合化疗方案的潜在方法包括靶向RTKs、丝裂原活化蛋白激酶、PI3K/AKT/mTOR信号通路中间体，或补充靶点如BCL-2或PARP。单药和组合在由来自具有一系列致癌KRAS变异体的癌症的19个恶性细胞系生长的多细胞类型肿瘤球体