间充质干细胞衍生培养基在急性移植物抗宿主病中的剂量-反应免疫调节作用

《Regenerative Therapy》：Dose-response immunomodulatory effects of Mesenchymal stem cell-derived culture-conditioned media in acute Graft-versus-Host Disease

本研究旨在优化间充质干细胞来源的细胞培养基（CCM）的剂量和收集时间，以增强其治疗急性移植物抗宿主病（aGVHD）的疗效，并标准化与CD3+ T细胞的共培养条件。通过分离骨髓（BM）和 Wharton's Jelly（WJ）来源的MSCs，在低氧条件下预处理24小时，收集24、48、72小时的CCM，并与aGVHD患者来源的CD3+ T细胞共培养。结果显示，48小时收集的50%浓度CCM在5×10^6 cells/ml的T细胞密度下效果最佳，显著抑制增殖，并提高CD4+/CD8+比值。WJ-MSCs-HYP的CCM优于BM-MSCs-HYP，证实低氧预处理和WJ来源的MSCs具有更强的免疫调节潜力。

　　这项研究探讨了源自间充质干细胞（MSCs）的培养条件培养液（CCM）在治疗急性移植物抗宿主病（aGVHD）中的应用潜力。研究团队通过优化CCM的浓度和收集时间，以及标准化CD3? T细胞与CCM的共培养条件，旨在提高其免疫调节效果。研究的主要发现表明，CCM在48小时时以50%浓度收集时，对CD3? T细胞的增殖具有最强的抑制作用，且这种效果在不同MSCs来源中表现一致。此外，通过低氧预处理的MSCs所分泌的CCM（即MSCsHYP-CCM）在免疫调节方面表现更优，尤其是来自脐带华通胶（WJ）的MSCsHYP-CCM，在抑制T细胞增殖、提高CD4?/CD8? T细胞比例以及减少CD4? T细胞激活方面均优于骨髓（BM）来源的MSCsHYP-CCM。

研究团队从BM和WJ中分离出MSCs，并在低氧条件下（1% O?）预处理24小时。随后，在24、48和72小时时间点收集CCM，并通过0.2μm膜过滤去除细胞碎片。为了评估CCM对T细胞增殖的影响，研究人员从aGVHD患者外周血单个核细胞（PBMNCs）中分离出CD3? T细胞，并在不同浓度（25%、50%、100%）和不同密度（2×10?、5×10?、10×10?细胞/ml）条件下进行共培养实验。通过MTS法检测细胞增殖，结果显示，在48小时收集的CCM中，50%浓度对T细胞增殖的抑制作用最为显著，特别是在5×10?细胞/ml的T细胞密度下。而在72小时收集的CCM中，无论浓度如何，均未能显著抑制T细胞增殖。

进一步的流式细胞术分析显示，WJ-MSCs-CCM相较于BM-MSCs-CCM，在抑制T细胞增殖和调节CD4?/CD8? T细胞比例方面更为有效。此外，低氧预处理显著增强了CCM的免疫调节能力，使得WJ-MSCsHYP-CCM在抑制T细胞激活方面表现出更强的效果。这些结果强调了WJ-MSCs在免疫调节方面的优势，特别是在低氧环境下，其分泌的生物活性分子能够更有效地调节免疫反应。

研究还发现，尽管100%浓度的CCM在某些条件下可能表现出较高的抑制效果，但实际应用中，50%浓度的CCM更符合治疗需求。这一现象可能与高浓度CCM中某些生物活性因子的反馈抑制机制有关，或者由于营养物质的消耗以及代谢产物的积累，可能对靶细胞产生不利影响。因此，确定CCM的最适浓度和收集时间对于实现最佳的免疫调节效果至关重要。

此外，研究团队通过系统分析不同MSCs来源的CCM，揭示了WJ-MSCs在免疫调节方面的优越性。WJ-MSCs相较于BM-MSCs，具有更高的增殖能力、更低的免疫原性和更强的免疫调节潜力。低氧预处理进一步增强了WJ-MSCs的免疫调节功能，使其在抑制T细胞增殖和减少其激活方面表现更为突出。这些发现为MSCs在临床中的应用提供了新的思路，尤其是在需要精准调控免疫反应的治疗场景中。

研究还指出，CCM的免疫调节效果不仅取决于其来源，还受到预处理策略和收集时间的影响。例如，低氧预处理可以显著提升MSCs的免疫调节能力，这可能与HIF-1α依赖性通路的激活有关，从而促进IDO、IL-10、TGF-β和PGE2等免疫抑制性分子的分泌。这些分子在免疫调节中起着关键作用，有助于减少炎症反应并促进组织修复。

研究团队在实验设计上采用了多种方法，包括MTS法和CFSE标记法，以评估T细胞的增殖情况。MTS法用于检测细胞活力和增殖水平，而CFSE标记法则能够更直观地观察T细胞的分裂过程。实验结果显示，48小时收集的CCM在50%浓度下对T细胞增殖的抑制效果最佳，且这种效果在不同T细胞密度下均保持稳定。而在72小时收集的CCM中，无论是哪种浓度，均未能显著抑制T细胞增殖，这表明在特定时间点内，MSCs的分泌活动可能达到峰值，之后其效果逐渐减弱。

为了进一步验证这些发现，研究团队还通过流式细胞术分析了T细胞的激活状态。结果显示，WJ-MSCsHYP-CCM能够显著降低CD4? T细胞的激活水平，这可能与其分泌的免疫抑制性分子有关。同时，WJ-MSCsHYP-CCM还能够促进CD4?/CD8? T细胞比例的增加，这种平衡可能有助于恢复正常的免疫功能，减少aGVHD的病理反应。

在讨论部分，研究团队指出，尽管已有大量关于MSCs免疫调节作用的研究，但对CCM的系统评估仍较为有限。本研究通过优化CCM的浓度和收集时间，以及比较不同MSCs来源的免疫调节效果，填补了这一知识空白。研究还强调了CCM在免疫调节中的动态性，即其生物活性成分会随着时间的推移发生变化，因此在实际应用中需要根据具体情况进行调整。

此外，研究团队提到，虽然他们未能直接量化某些关键免疫调节因子，如PGE2、IDO、TGF-β和IL-10，但这并不影响他们对CCM整体免疫调节能力的评估。未来的研究可以结合靶向因子分析，进一步探索这些分子在免疫调节中的具体作用机制，从而为MSCs相关疗法的开发提供更深入的理论依据。

研究的意义在于，它为aGVHD的治疗提供了一种新的细胞外治疗策略。通过优化CCM的使用条件，研究人员不仅提高了其免疫调节效果，还为未来的临床转化奠定了基础。这种细胞外疗法避免了传统MSCs治疗中的诸多挑战，如供体差异、细胞活性和治疗效果的不一致性，同时保留了MSCs的免疫调节潜力。

研究团队的结论强调了MSCs-CCM在免疫调节中的重要性，并指出其在治疗aGVHD中的潜在价值。通过系统评估CCM的剂量和收集时间，以及比较不同MSCs来源的免疫调节效果，研究人员为开发标准化、可扩展且有效的细胞外疗法提供了关键数据支持。这些成果不仅有助于推动MSCs在免疫治疗领域的应用，也为未来研究提供了新的方向，特别是在探索不同预处理策略对CCM免疫调节能力的影响方面。

总的来说，这项研究展示了MSCs-CCM在免疫调节中的独特优势，并为优化其治疗效果提供了重要的实验依据。通过调整CCM的浓度和收集时间，研究人员成功提高了其对T细胞增殖的抑制能力，同时增强了其对免疫反应的调控作用。这些发现对于改进MSCs治疗策略、降低临床应用中的不确定性具有重要意义。此外，研究还揭示了WJ-MSCs在免疫调节方面的潜力，特别是在低氧预处理条件下，其分泌的CCM表现出更强的免疫抑制能力。这些结果不仅为aGVHD的治疗提供了新的思路，也为其他免疫相关疾病的治疗策略提供了参考。