炭疽杆菌荚膜早期表达及丝状结构特征的电子显微镜研究

本研究发现炭疽杆菌（Bacillus anthracis）在孢子萌发15分钟内即可表达荚膜，并首次通过钌红-赖氨酸乙酸酯增强固定技术，在透射电镜（TEM）和扫描电镜（SEM）下观察到感染过程中荚膜形成的长分支丝状结构。该研究揭示了荚膜超微结构在宿主内的动态变化，为理解炭疽致病机制提供了新的形态学证据。

　　

Highlight

炭疽杆菌荚膜在萌发后很快表达，在外孢叶脱落前即可检测到

为了在宿主体内存活和传播，炭疽杆菌会产生荚膜，使杆菌能够避免吞噬。为了确定荚膜表达的时间，我们将来自完全毒力荚膜菌株的孢子接种到荚膜诱导培养基中，并使用荧光显微镜观察活杆菌上的荚膜，如材料和方法中所述。我们在接种后15分钟（检查的最早时间点）检测到荚膜表达（图1A-B）。在外孢叶脱落的杆菌上未观察到荚膜（数据未显示）。为了确认这些观察结果，我们使用针对荚膜的抗体和免疫金标记进行了免疫电子显微镜（IEM）检查。在接种后30分钟，我们观察到萌发孢子表面有免疫金颗粒（图1C）。在某些情况下，当杆菌从外孢叶中出现时，它们已经完全被荚膜包裹（图1D）。这些结果表明，荚膜在萌发过程早期表达，并且在外孢叶脱落的很早之前，杆菌就可能被荚膜完全包裹。

使用增强固定方法揭示炭疽杆菌荚膜的串珠状和丝状结构

使用常规固定剂（例如多聚甲醛-戊二醛，PFA-G）制备用于透射电镜（TEM）的样本，导致大部分荚膜材料丢失，在杆菌周围留下一个清晰的空间（图2A）。为了改善荚膜的保存，我们测试了一种含有阳离子染料钌红（RR）和赖氨酸乙酸盐的固定剂，该固定剂先前已被用于稳定细菌糖萼用于电子显微镜（EM）观察。使用这种增强的固定方法，在体外生长的炭疽杆菌（图2B）和从濒死动物脾脏中回收的细胞外杆菌（图2C）周围观察到一个厚的荚膜层。在更高的放大倍数下，体外生长的杆菌的荚膜呈现出由球形结构组成的串珠状外观（图2D）。当使用增强固定方法检查时，组织中的细胞外杆菌被厚的荚膜层包围，并且具有长的分支丝状物（图2E），类似于通过荧光显微镜在活菌上观察到但在固定细菌上未观察到的结构。使用增强固定方法的扫描电子显微镜（SEM）同样显示，脾窦内的炭疽杆菌被长的分支丝状物覆盖，这些丝状物似乎将它们锚定到宿主细胞上（图3A-D）。这是在体内感染过程中存在长荚膜丝状物的首次报道。

讨论

炭疽杆菌荚膜是一个主要的毒力决定因子，对于细菌在受感染宿主体内的传播是必需的。考虑到荚膜对致病机制的关键程度，我们想确定萌发后多久会产生荚膜。使用荧光显微镜，我们显示在体外孢子萌发后最早15分钟（检查的最早时间点）就产生了荚膜，这证实了Ezzell和Abshire以及Fastenackels等人先前的发现，他们分别报告在萌发后30分钟和60分钟检测到荚膜。此外，我们使用IEM证实了这些发现，并证明在某些情况下，当杆菌从外孢叶中出现时，它们可能已经完全被荚膜包裹。