三角褐指藻乳酸代谢调控碳氮平衡的功能解析及其在脂质合成中的关键作用

本研究针对海洋硅藻三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）碳氮代谢调控机制不明的科学问题，开展了乳酸代谢关键基因（ldhA、Glo1、Glo2、D-LCR等）功能表征研究。通过基因过表达和RNA沉默技术，发现LDHA、GLO1、GLO2和D-LCR介导的乳酸代谢和乳酸化修饰过程，能够促进低氮条件下外源乳酸的利用、加速糖酵解/TCA循环/卡尔文循环等碳代谢过程，并显著提高脂质积累（总脂含量提升约20%）。该研究揭示了乳酸通过蛋白质乳酸化修饰调控微藻碳氮平衡的新机制，为高脂微藻株系开发提供了理论依据。

　　

海洋硅藻作为全球初级生产力的重要贡献者，承担着约20%的碳固定任务，其中三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）因其基因组完全测序而成为研究硅藻生理生化过程的模式生物。这种微藻不仅在水产养殖中作为饵料具有重要价值，其富含的多不饱和脂肪酸更使其成为高附加值产品开发的理想候选。然而，如何通过代谢调控提高其脂质产量一直是研究者面临的挑战。

前期研究发现，在高碳氮比条件下，三角褐指藻内源乳酸水平显著升高，且乳酸化蛋白质在碳氮代谢和能量代谢过程中富集，暗示乳酸可能通过蛋白质乳酸化修饰参与代谢调控。此外，外源乳酸的添加也被证明能够显著影响三角褐指藻的生长特性和生化组成合成。但这些研究尚未揭示乳酸代谢关键基因的具体功能及其调控机制。

为了深入解析乳酸代谢在三角褐指藻碳氮平衡中的作用机制，研究人员在《Microbial Cell Factories》上发表了最新研究成果。该研究通过构建乳酸代谢关键基因（ldhA、Glo1、Glo2、D-LCR、GlxI和GPCR）的过表达（OE）和RNA沉默（AS）株系，结合生理生化测定、Western blot、¹³C标记分析和转录组测序等技术，系统阐明了这些基因在乳酸代谢和碳氮调控中的功能。

研究采用的主要技术方法包括：基因工程改造（过表达和RNA沉默载体构建）、生理生化指标检测（生长曲线、光合参数、色素含量、脂质/蛋白质/糖类含量测定）、蛋白质免疫印迹（LDHA表达和乳酸化修饰水平检测）、稳定同位素标记（¹³C-乳酸和¹³C-碳酸氢钠标记追踪碳流）和转录组测序（差异基因表达和通路富集分析）。实验使用三角褐指藻野生型（WT）和转基因株系，在正常培养（NC）、低氮（LN）、乳酸添加（NC+L）和低氮加乳酸（LN+L）四种条件下进行比较分析。

成功构建转基因株系并验证

研究人员成功将目标基因表达盒插入pPha-T1载体，并通过电转法导入三角褐指藻细胞。分子验证显示转基因株系在DNA和mRNA水平均成功整合并表达目标基因（图S1-S5）。Western blot分析进一步证实ldhA过表达株系在低氮和乳酸添加条件下LDHA蛋白表达显著上调（图3）。

乳酸代谢关键基因的生理功能

实验结果表明，ldhA、Glo1、Glo2和D-LCR的过表达显著提高了三角褐指藻在低氮条件下的外源乳酸利用速率（图1）。其中ldhA过表达株系在低氮条件下表现出更强的生长优势，总脂含量显著高于野生型（图2k）。相反，GlxI和GPCR过表达株系的生长和乳酸消耗速率与野生型无显著差异或更低（图S9-S10）。

乳酸化修饰的检测与分析

Pan-乳酸化赖氨酸Western blot分析显示，ldhA过表达株系出现约40 kDa的特异性乳酸化蛋白条带（图4），表明ldhA过表达促进了特定蛋白质的乳酸化修饰。这一发现为乳酸通过蛋白质修饰调控代谢提供了直接证据。

¹³C标记揭示碳流分配变化

¹³C标记实验表明，在¹³C-乳酸混合培养条件下，ldhA过表达株系比野生型更快地利用乳酸，各种游离氨基酸的标记程度更高，特别是丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸和谷氨酸/谷氨酰胺（表1）。代谢通路分析显示ldhA过表达加速了糖酵解、TCA循环、CCM（二氧化碳浓缩机制）和卡尔文循环（图5）。而在¹³C-碳酸氢钠培养条件下，野生型对碳酸氢钠的利用更快，表明ldhA过表达改变了碳源利用偏好。

13C标记实验中游离氨基酸代谢通路'>

转录组分析揭示代谢通路调控

RNA-Seq分析发现，在低氮条件下，ldhA过表达株系的差异表达基因显著富集于细胞分裂代谢和三羧酸循环过程（图6a）。KEGG富集分析显示这些基因主要参与脂肪酸延伸、不饱和脂肪酸生物合成和花生四烯酸代谢（图6b），这与脂质含量增加的结果一致。

在乳酸添加条件下，ldhA过表达株系的差异表达基因显著富集于光系统II、光合作用和光捕获等过程（图8a），以及光合作用、糖酵解/糖异生、TCA循环、赖氨酸生物合成、氮代谢和光合生物碳固定等通路（图8b）。与光合作用相关的岩藻黄素-叶绿素a/c蛋白复合体编码基因（Lhcf1-11、Lhcf13-17、Lhcr1-4等）大多显著上调（表3），这解释了过表达株系光合效率和光合色素含量更高的现象。

研究还发现，参与磷脂酰肌醇信号系统的基因在ldhA过表达株系中表达上调（表3），表明乳酸代谢可能通过影响信号转导调节能量平衡和碳氮平衡。此外，与甘油磷脂代谢相关的基因也显著上调，这与脂质积累增加的结果相吻合。

本研究系统阐明了三角褐指藻中乳酸代谢关键基因的功能及其调控机制。研究发现LDHA、GLO1、GLO2和D-LCR介导的乳酸代谢和乳酸化修饰过程是乳酸影响三角褐指藻生长、快速调节碳氮代谢过程和促进低氮条件下脂质积累的重要机制。具体而言，ldhA过表达促进了约40 kDa蛋白质的乳酸化修饰，加速了乳酸利用、糖酵解、TCA循环、CCM和卡尔文循环过程，在低氮和乳酸添加条件下促进了脂质积累。

这些发现不仅揭示了乳酸在微藻碳氮代谢调控中的新功能，还为通过代谢工程手段提高微藻脂质产量提供了重要靶点。研究的创新之处在于首次系统鉴定了三角褐指藻中乳酸代谢关键基因的功能，揭示了乳酸通过蛋白质乳酸化修饰调控代谢的新机制，并证明了靶向改造乳酸代谢途径可以提高微藻在逆境条件下的生长性能和脂质积累能力。

该研究建立的乳酸代谢调控网络模型为理解微藻碳氮平衡提供了新视角，也为开发高产脂质微藻株系提供了理论依据和技术支撑。未来研究可进一步探索乳酸化修饰的具体靶点蛋白及其功能，以及这些发现在其他产油微藻中的应用潜力。