评估不同储存温度与冷冻方案对非洲叶菜类作物刺苋种子及节段外植体保存效果的研究

本研究针对非洲叶菜类作物刺苋(Amaranthus dubius)种质资源保存难题，系统评估了多种冷冻方案(控速冷却、液氮浸没、液氮浆浸没)及储存温度(24°C至-196°C)对种子和节段外植体保存效果。研究发现种子在-20°C和-80°C储存4年仍保持86-88%发芽率，控速冷却处理的节段外植体在-196°C储存后仍维持80%芽发育率及NHX1基因表达稳定性，为孤儿作物种质资源保存提供了关键技术支撑。

　　

在非洲大陆的农田里，生长着一种营养价值卓越的传统叶菜——刺苋(Amaranthus dubius)。这种被称作"非洲叶菜类作物"(African leafy vegetable, ALV)的植物富含维生素、矿物质和蛋白质，是解决非洲地区粮食安全和营养不良问题的关键作物之一。然而，随着气候变迁和农业集约化发展，刺苋的遗传资源正面临严重威胁。更令人担忧的是，这类"孤儿作物"(orphan crop)往往缺乏系统性的种质资源保存方案，其优良基因型可能随着时间流逝而永久消失。

传统种子保存方法虽然简单易行，但长期储存后易出现遗传变异，无法保证优良性状的稳定传递。而现代冷冻保存技术(cryopreservation)虽能长期保持遗传稳定性，但对刺苋这类作物的适用性尚不明确。特别是冷冻过程中产生的应激反应可能影响组织再生能力和基因表达，这些分子水平的变化直接关系到作物的抗逆性和农艺性状。

面对这一挑战，南非夸祖鲁-纳塔尔大学生命科学学院的Ashiq Haripershad、Muhammad Nakhooda和Shakira Shaik研究团队在《South African Journal of Botany》上发表了他们的最新研究成果。该研究系统评估了多种温度条件(-196°C至24°C)和冷冻方案对刺苋种子和节段外植体保存效果的影响，并首次采用NHX1基因(Na⁺/H⁺ exchanger)表达分析这一分子标记来评估冷冻保存后的遗传保真性。

研究人员采用多重技术路线开展研究：首先通过种子发芽实验评估不同储存条件的保存效果，使用控速冷却装置(Mr Frosty?)和液氮浆等处理方法；其次建立体外繁殖体系，对节段外植体进行冷冻保存后再生评估；最后利用RT-qPCR技术定量分析盐胁迫耐受基因NHX1在冷冻处理后的表达变化。实验材料包括从南非德赛纳加尔采集的野生型种子和先前鉴定的耐盐基因型S4。

种子冷冻保存：-20°C与-80°C储存4年仍保持高发芽率

研究发现，刺苋种子在-20°C和-80°C条件下储存4年后，发芽率分别达到86%和88%，与未储存对照组的92%无显著差异。特别值得注意的是，经过控速冷却处理的种子在不同储存温度下都能保持较好的活力状态。而液氮浆快速冷冻后储存于-80°C的种子甚至表现出94%的最高发芽率，显著高于室温储存组(82%)。这表明适当的冷冻处理不仅能保持种子活力，甚至可能激活某些保护机制。

然而，高发芽率并不完全等同于良好的幼苗生长势。研究显示，液氮浆处理的种子虽然发芽率高，但产生的幼苗在叶面积、根鲜重等生长指标上表现较差，说明快速冷冻可能对后续生长发育产生隐性影响。相比之下，控速冷却处理的种子在维持生长性状方面表现更优，这表明缓慢的降温过程更有利于保护细胞的完整性。

节段外植体冷冻保存：控速冷却展现最佳再生效果

对于节段外植体的保存，控速冷却后储存于-196°C的方法表现出与未处理对照组相当的芽发育率(80%)，每个外植体平均产生3.6±0.6个新芽。在根系发育方面，控速冷却结合-148°C和-196°C储存的处理组保持了与对照组相当的根伸长速率(1.5±0.4 cm/周)。相比之下，直接液氮浸没的处理组根伸长速率普遍低于1.0 cm/周，表明超快速冷冻可能对基部组织造成机械损伤。

叶片生物量是衡量植株恢复状况的重要指标。所有储存处理组的叶鲜重均低于未处理对照组，但控速冷却处理组最接近对照值，仅下降约10%。这一结果印证了控速冷却在保护光合组织完整性方面的优势，这对于叶菜类作物的品质保持尤为重要。

遗传保真性评估：NHX1基因表达揭示冷冻应激响应

研究最创新的部分在于对耐盐基因NHX1表达水平的分析。结果显示，控速冷却后储存于-148°C的样品在400 mM NaCl胁迫下，NHX1相对表达量达到10.2±1.3，高于未储存对照组的9.7±0.6。这表明适当的冷冻处理不仅没有破坏基因功能，反而可能增强了植物的应激响应能力。

更有趣的是，即使在未施加盐胁迫的条件下，部分冷冻处理组也出现了NHX1基因的上调表达，暗示该基因可能参与多种应激响应通路，包括冷冻应激的恢复过程。这一发现为理解植物在分子水平上应对冷冻胁迫的机制提供了新视角。

研究结论与意义：为孤儿作物种质保存提供技术范式

本研究系统证明了-20°C和-80°C是刺苋种子中长期保存的适宜温度，而控速冷却结合-196°C储存是节段外植体冷冻保存的最佳方案。更重要的是，通过NHX1基因表达分析建立的遗传保真性评估方法，为作物种质资源保存效果提供了分子水平的评价标准。

这项研究的意义不仅在于为刺苋这一特定作物提供了优化保存方案，更重要的是建立了一套适用于孤儿作物的种质资源保存评估体系。通过整合传统农艺性状观察和现代分子生物学技术，该研究为非洲乃至全球的作物多样性保护提供了技术范式。在气候变化和粮食安全挑战日益严峻的背景下，这种针对区域性重要作物的保护研究显得尤为珍贵，为实现可持续农业发展和 biodiversity 保护提供了科学支撑。