N-Fmoc二苄基吡唑基磷酸酯保护型τ-磷酰组氨酸构建块的合成，用于Fmoc SPPS（固相肽合成）

《Synthetic Communications》：Synthesis of a N-Fmoc dibenzyl pyrazolyl phosphonate protected τ-phosphohistidine building block for Fmoc SPPS

稳定磷组氨酸类似物合成及在Fmoc-SPPS中的应用

　　在生物学研究中，磷酸化组氨酸（phosphohistidine，简称pHis）作为一种重要的后翻译修饰（post-translational modification）形式，被广泛认为与多种生命过程及疾病状态相关。然而，由于pHis在酸性和生理条件下具有不稳定性，其直接研究存在一定的技术挑战。为此，科学家们致力于开发稳定且可被引入肽链的pHis类似物，以便更有效地探索其在生物系统中的作用。本文讨论了如何通过合成策略获得一种新型的磷吡唑基侧链（phosphopyrazolyl side chain）构建模块，并将其用于构建稳定的pHis类似物肽，从而支持进一步的生物研究。

pHis的两种主要异构体——τ-pHis和π-pHis——在结构和功能上均存在差异，其中τ-pHis的稳定性更为重要。在抗体生成研究中，τ-pHis的类似物已被证明能够产生更具选择性的抗体，这为研究其在生物体内的具体作用提供了有力工具。为了实现这一目标，研究团队设计了一种新型的磷吡唑基侧链构建模块，该模块在合成过程中采用了Fmoc固相肽合成（Fmoc-SPPS）策略，从而能够更方便地引入到肽链中。这一构建模块的合成路径涉及多个关键步骤，包括Hirao交叉偶联反应（Hirao cross coupling reaction）和Vederas β-内酯开环反应（Vederas Boc-β-lactone opening reaction），这些反应在有机合成领域具有广泛的应用。

在合成过程中，研究团队首先利用Hirao交叉偶联反应合成磷吡唑基侧链。这一反应通常用于连接卤代吡唑与磷试剂，生成相应的磷吡唑化合物。为了简化合成步骤，研究者尝试在不使用N-保护基的情况下进行交叉偶联反应。他们选择了一种常用的磷试剂——二苯基磷酸酯（dibenzyl phosphite），并与4-碘代吡唑（4-iodopyrazole）进行反应。这一反应在微波辅助条件下进行，不仅提高了反应效率，还减少了副反应的发生。实验结果显示，在微波条件下，使用Xantphos作为配体，可以显著提高反应的产率。此外，通过改变反应条件，如使用更强大的碱（如EtN*iPr2）和增加钯催化剂的用量，进一步优化了反应过程，使磷吡唑基侧链的产率达到60%。

在获得磷吡唑基侧链之后，研究团队进一步将其引入到肽合成中。为此，他们利用了Vederas β-内酯开环反应，该反应能够将磷吡唑基侧链连接到β-内酯结构上，从而生成相应的氨基磷酸酯化合物。在这一过程中，他们使用了商业化的Vederas Boc-β-内酯（Vederas Boc-β-lactone）作为反应底物，并在碱性条件下进行反应。实验表明，使用DBU（1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯）作为碱能够有效促进磷吡唑基侧链与β-内酯的开环反应，从而生成N-Boc保护的氨基磷酸酯。随后，通过选择性去除N-Boc保护基并引入Fmoc保护基，最终得到了N-Fmoc二苯基吡唑基磷酸酯（N-Fmoc dibenzyl pyrazole phosphonate）构建模块，该模块能够被方便地引入到肽链中。

这一构建模块的合成不仅简化了pHis类似物的制备过程，还提高了其在生物系统中的应用潜力。传统的合成方法通常需要对吡唑进行N-保护，然后再进行去保护步骤，这不仅增加了合成步骤的数量，还可能引入不必要的副反应。相比之下，本文所采用的合成策略避免了这些复杂的保护和去保护过程，使得整个合成路径更加高效和可控。此外，通过微波辅助反应，研究团队能够在较短的时间内完成合成，同时减少因碘化物离子释放而导致的副反应，进一步提高了产物的纯度和产率。

在实验过程中，研究者对反应条件进行了系统性优化。例如，他们发现使用EtN*iPr2作为碱能够有效提高反应的产率，同时减少反应时间。此外，增加钯催化剂的用量也对反应效率产生了积极影响。通过调整这些参数，研究团队成功地将磷吡唑基侧链的合成时间从150分钟缩短至45分钟，同时将产率从38%提高至60%。这些优化措施不仅提高了合成效率，还为后续的肽合成提供了更可靠的构建模块。

在后续的肽合成过程中，研究团队验证了该构建模块在Fmoc-SPPS策略中的应用。通过将磷吡唑基侧链引入到肽链中，他们成功合成了包含该侧链的肽分子，并进一步评估了其在生物系统中的稳定性。实验结果表明，该构建模块能够有效维持pHis类似物的稳定性，使其在酸性和生理条件下不易分解。这一特性对于研究pHis在生物体内的功能具有重要意义，因为许多生物过程发生在这些环境中。

此外，研究团队还探讨了该构建模块在抗体生成中的潜在应用。由于pHis在生物系统中的不稳定性，传统方法难以获得足够的pHis类似物用于抗体生成。然而，本文所开发的磷吡唑基侧链构建模块具有较高的稳定性，因此可以作为τ-pHis类似物的替代品，用于生成更具选择性的抗体。这一应用不仅拓展了pHis类似物的研究范围，还为相关疾病的诊断和治疗提供了新的思路。

在实验数据方面，研究团队对合成的磷吡唑基侧链进行了详细的结构表征。通过核磁共振（NMR）技术，他们确认了化合物的化学结构，并对其化学性质进行了分析。例如，¹H NMR数据显示，磷吡唑基侧链中的氢原子在特定的化学位移范围内，表明其结构的正确性。此外，¹³C NMR和³¹P NMR结果进一步验证了该化合物的化学组成和结构特征。这些表征数据为后续的肽合成和功能研究提供了可靠的依据。

研究团队还对合成的磷吡唑基侧链进行了质谱分析，以确认其分子量和纯度。实验结果表明，化合物的分子量与理论值相符，且在质谱图中显示出清晰的峰，说明其纯度较高。这些分析结果不仅证明了合成方法的有效性，还为后续的生物实验提供了高质量的试剂。

综上所述，本文所开发的N-Fmoc二苯基吡唑基磷酸酯构建模块为pHis类似物的合成提供了新的途径。通过优化合成条件，研究团队成功提高了磷吡唑基侧链的产率，并减少了合成步骤的数量。这一构建模块的合成不仅简化了pHis类似物的制备过程，还提高了其在生物系统中的应用潜力。此外，该构建模块在抗体生成中的应用也显示出良好的前景，为相关研究提供了重要的工具。未来，随着该构建模块的广泛应用，有望进一步揭示pHis在生物过程中的具体作用，并为相关疾病的诊断和治疗提供新的思路。