UGI在Cas9内部重定位可降低胞嘧啶碱基编辑器的Cas9依赖性脱靶效应

本研究针对经典胞嘧啶碱基编辑器(CBE)存在Cas9依赖性DNA脱靶的难题，通过将尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)重定位至nCas9内部区域，开发出新型高保真CBE变体。系统筛选发现UGI插入nCas9第1282位点（YE1-UGI-1282）可在维持高效靶向编辑（>50% C-to-T转化率）的同时，将EMX1、HBG1等位点的脱靶效率降低至0.08%-4.65%，靶向选择性提升37-104倍。该策略为精准基因组编辑提供了新范式。

　　

基因组编辑技术的革新始终围绕着精准性与效率的平衡展开。胞嘧啶碱基编辑器(CBE)作为CRISPR系统的重要衍生工具，能够在不引起DNA双链断裂的情况下实现C·G到T·A的精确转换，为遗传病治疗提供了新途径。然而，经典CBE在展示高效靶向编辑能力的同时，存在显著的Cas9依赖性DNA脱靶效应，这成为其临床应用的潜在风险。传统解决方案多聚焦于优化Cas9蛋白本身，但往往以牺牲编辑效率为代价。

面对这一挑战，复旦大学儿科医院的研究团队另辟蹊径，从UGI（尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂）的空间排布入手，提出了全新的解决方案。UGI是CBE系统的关键组分，通过抑制细胞内源的UDG（尿嘧啶DNA糖基化酶）活性，阻止U·G中间体被修复为原始C·G对，从而保障C-to-T编辑效率。然而，传统CBE将UGI融合于nCas9（切口酶Cas9）羧基末端的设计，在增强靶向编辑的同时也同步放大了脱靶效应。

研究团队创新性地提出假设：将UGI整合至nCas9内部特定区域，可能通过空间重构实现差异化调控——在靶标区域保持UGI对UNG（尿嘧啶-N-糖基化酶）的有效抑制，而在脱靶位点减弱其抑制作用，从而在维持编辑效率的同时提升特异性。这一设想源于前期研究中deaminase（脱氨酶）结构域内嵌策略的成功实践，该策略已证实能增强碱基编辑的精确度。

为验证这一理论，研究团队选取具有低Cas9非依赖性脱靶活性的YE1-CBE为框架，在nCas9的23个特定位点系统性地插入UGI，构建了YE1-UGI-X系列变体。同时，借鉴split-Cas9（分裂Cas9）可降低脱靶活性的特性，额外构建了包含P2A（自切割肽）接头的YE1-2A-UGI-X变体，探讨UGI分离表达对编辑特性的影响。

关键技术方法

研究通过分子克隆构建UGI内嵌nCas9的CBE变体，在HEK293T细胞中转染评估编辑效率。利用流式细胞分选GFP/mCherry双阳性细胞，针对HEK4等内源位点进行靶向编辑分析，并通过高通量测序（Illumina NovaSeq 6000）和CRISPResso2定量脱靶效应。系统评估了EMX1、HBG1、BCL11A等相关脱靶位点。

UGI重定位变体的筛选与验证

通过在内源性HEK4位点评估靶向编辑效率，并在已知脱靶位点OT2分析脱靶活性，研究发现20个YE1-UGI-X变体保持高于50%的C-to-T转换效率，其中20个变体显著降低OT2位点的Cas9依赖性脱靶活性。YE1-2A-UGI-X变体中16个保持高效靶向编辑，21个显著降低脱靶效应。值得注意的是，无UGI对照YE1-no UGI的C-to-T效率显著降低（平均12.6%），且引发较高比例的C-to-A（平均8.8%）和C-to-G（平均36.3%）非目标转换，证实UGI在重定位变体中功能完整。

选择性变体的脱靶特征分析

选取五个YE1-UGI-X（X=113,535,1029,1154,1282）和五个YE1-2A-UGI-X（X=312,459,715,1154,1282）变体进行系统评估。经典YE1-CBE在三个EMX1相关脱靶位点编辑范围为6.44%-19.62%，一个BCL11A脱靶位点为4.39%。而YE1-UGI-1282变体将这些位点的脱靶效率大幅降低至0.47%（EMX1-OT2）、4.65%（EMX1-OT3）、0.50%（EMX1-OT4）和0.84%（BCL11A-OT1）。

靶向选择性的显著提升

YE1-UGI-1282的靶向/脱靶选择性比率较经典YE1提升37-104倍。对于EMX1相关脱靶位点，选择性比率达到122.2（YE1：3.3）、12.4（YE1：6.1）和115.3（YE1：10.0）；HBG1相关位点提升至345.4和334.5（YE1：128.4和132.1）；BCL11A位点提升至84.6（YE1：21.1）和103.4（YE1：76.5）。

策略的普适性验证

为验证UGI重定位策略的广泛适用性，研究团队在nCas9第1282位点整合UGI，测试了两种重编程TadA8e（ tRNA腺苷脱氨酶8e）变体GC（V28G-N46C）和GGATY（V28G-A48G-I49A-V82T-N108Y）。经典TadA8e(GC)-CBE和TadA8e(GGATY)-CBE在HEK4-OT2脱靶效率分别为30.6%和38.1%，而修饰后变体分别降至4.3%和3.03%，EMX1脱靶效率也显著降低。

多基因位点编辑效能确认

在五个额外内源位点的评估证实，1282位点UGI重定位变体保持与经典C末端UGI融合相当的靶向编辑活性。所有CBE变体的非C-to-T转换频率均低于1%，而YE1-no UGI则引发高达70.7%的非目标转换。

研究结论与意义

本研究通过UGI在nCas9内部的空间重定位，成功开发出兼具高编辑效率与低脱靶活性的新型CBE变体。第1282位点被确定为最优整合位点，其介导的变体在多个基因组位点展示出显著提升的靶向选择性。该策略不同于传统的Cas9工程或UGI剂量优化，通过功能结构域的空间重构实现了编辑精度的突破，为下一代高保真碱基编辑器的开发提供了新范式。值得注意的是，这一工程理念可扩展至其他功能结构域的优化，具有广泛的应用前景。研究成果发表于《Scientific Reports》，为精准医学领域的基因组编辑工具创新提供了重要技术支撑。