苹果MdHSFA2通过调控MdGolS4转录增强耐热性的分子机制研究

本研究针对全球气候变化导致的高温胁迫严重制约苹果产业发展的突出问题，以苹果热激因子MdHSFA2和肌醇半乳糖苷合成酶MdGolS4为研究对象，通过转基因技术、电泳迁移率变动分析(EMSA)和双荧光素酶报告基因检测等技术，首次揭示了MdHSFA2通过直接结合MdGolS4启动子区域并促进其转录，从而增强苹果耐热性的分子通路，为苹果抗逆育种提供了重要理论依据和基因资源。

　　

随着全球气候变暖的加剧，夏季极端高温天气频发，这对世界苹果主产区的产业发展造成了严重威胁。作为全球最大的苹果生产国，中国苹果产业正面临着高温胁迫导致的产量下降和品质劣化等严峻挑战。苹果作为蔷薇科落叶果树，其生长发育对温度变化尤为敏感，因此解析苹果应对高温胁迫的分子机制，培育耐热性新品种已成为当前苹果产业亟待解决的关键科学问题。

在植物应对高温胁迫的复杂调控网络中，热激因子(HSF)作为关键信号分子发挥着核心作用。这类转录因子能够特异性识别并结合下游靶基因启动子中的热激元件(HSE)，激活热激蛋白(HSP)等相关基因的表达，从而增强植物的耐热性。然而，关于苹果HSF基因在耐热性调控中的具体功能及其作用机制尚不清楚。同时，肌醇半乳糖苷合成酶(GolS)作为棉子糖家族寡糖(RFOs)生物合成途径的关键酶，在植物逆境响应中具有重要功能，但其在苹果耐热性中的作用及其与HSF的调控关系仍有待阐明。

本研究以'长富2号'苹果为材料，系统研究了MdHSFA2在高温胁迫下的表达特性及其功能，并进一步探讨了其下游靶基因MdGolS4的耐热性调控作用。研究人员通过多种分子生物学技术手段，揭示了MdHSFA2-MdGolS4调控模块在苹果耐热性形成中的重要作用，为理解苹果高温胁迫响应机制提供了新的视角。

研究采用的主要技术方法包括：通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析基因表达模式；利用农杆菌介导的遗传转化技术获得过表达转基因拟南芥株系；采用电泳迁移率变动分析(EMSA)和双荧光素酶报告基因检测技术验证转录因子与靶基因启动子的直接结合与转录激活作用；通过系统进化分析和亚细胞定位确定基因的保守性与蛋白定位特征。

Sequence and expression analysis of apple MdHSFA2

研究人员首先对9种植物物种的HSFA2蛋白进行多序列比对，发现它们均包含保守的HSF结构域，表明HSFA2在不同植物中具有较高的保守性。系统进化分析显示，苹果MdHSFA2与同属蔷薇科的桃和梨亲缘关系最近。表达分析发现，高温处理显著诱导了MdHSFA2的表达，在处理6小时后达到最高水平，提示该基因可能参与苹果的热胁迫响应通路。

Overexpression of MdHSFA2 enhances heat-stress tolerance

为了验证MdHSFA2的功能，研究人员将其在拟南芥中过表达。高温处理实验表明，MdHSFA2过表达株系比野生型具有显著更高的存活率。基因表达分析发现，转基因拟南芥中热激蛋白基因AtHSP70、AtHSP70T以及肌醇半乳糖苷合成酶基因AtGolS1、AtGolS2的表达水平均显著上调，证明MdHSFA2能够增强植物的耐热性。

Expression analysis of apple MdGolSs after heat treatment

研究人员进一步分析了苹果中8个MdGolS基因在高温胁迫下的表达模式。结果显示，除MdGolS2外，其他MdGolS基因的表达均受高温诱导而上调，其中MdGolS4和MdGolS6的表达水平增加最为显著，在处理3小时后表达量增加超过100倍，表明这两个基因可能在苹果耐热性中发挥重要作用。

Apple MdHSFA2 directly binds to the MdGols4 promoter

通过克隆分析MdGolS4启动子区域，研究人员发现了潜在的HSF结合位点。EMSA实验证实MdHSFA2蛋白能够直接结合MdGolS4启动子区域，而双荧光素酶报告基因检测进一步表明MdHSFA2可以显著促进MdGolS4的转录活性，证明了两者之间存在直接的调控关系。

Apple MdGolS4 sequence and subcellular localization analysis

生物信息学分析显示，MdGolS4在9种植物物种中均含有保守的PLN00176结构域，系统进化分析表明其与蔷薇科植物亲缘关系最近。亚细胞定位实验发现MdGolS4蛋白定位于细胞核和细胞质中，这与其作为代谢酶的功能定位相符。

MdGolS4 overexpression enhances heat-stress tolerance

功能验证实验表明，MdGolS4过表达拟南芥株系在高温胁迫下比野生型具有显著更高的存活率，证明MdGolS4确实在植物耐热性中发挥重要作用，是MdHSFA2下游的关键效应因子。

本研究通过系统的实验证据构建了苹果响应高温胁迫的分子调控模型：高温胁迫诱导MdHSFA2表达，其编码的转录因子蛋白直接结合MdGolS4启动子区域，激活MdGolS4转录，进而通过调控肌醇半乳糖苷和棉子糖家族寡糖的合成，增强苹果的耐热性。这一MdHSFA2-MdGolS4调控通路的发现不仅深化了对植物高温胁迫响应机制的理解，而且为苹果耐热性育种提供了重要的候选基因和理论依据。

该研究成果发表于《Scientific Reports》期刊，首次在苹果中揭示了HSF与GolS之间的直接调控关系，为蔷薇科果树抗逆育种提供了新的思路。随着气候变化影响的加剧，这一研究成果对于保障苹果产业可持续发展具有重要的理论和实践意义，同时也为其他作物的耐热性改良提供了可借鉴的分子机制模型。