人脐静脉内皮细胞无血清化学限定培养基的优化方案与适应策略

本研究针对血清培养基存在的批次差异性和成分不明确等问题，开发了人脐静脉内皮细胞(HUVEC)向化学限定培养基(CD medium)过渡的标准化方案。通过比较直接适应(DA)与逐步适应(GA)策略，结合纤维连接蛋白(fibronectin)等细胞外基质涂层优化，成功实现了HUVEC在无血清条件下的稳定培养。该方案为生物测定和转化研究提供了可重复的细胞培养平台，符合FDA新方法学(NAM)等减少动物使用的法规要求。

　　

在生物医学研究领域，细胞培养是基础实验的关键环节。然而，传统含血清培养基(SC medium)的使用却如同一把双刃剑：虽然能有效促进细胞生长，但其成分不明确、批次差异大等缺陷，导致实验结果难以重复，这就是长期困扰学界的"可重复性危机"。更令人担忧的是，血清中可能存在的病原体、卤代有机物、双酚A(BPA)和全氟烷基物质(PFAS)等污染物，还会对细胞实验数据造成干扰。

随着美国FDA现代化法案2.0和NIH国家毒理学计划Tox21等法规的推进，减少动物源性材料使用、开发化学成分明确(CD)的培养基已成为必然趋势。但将已适应血清的细胞（尤其是敏感贴壁细胞）成功过渡到CD培养基并非易事，细胞常出现生长抑制、贴附能力下降和表型丢失等问题。

在这项发表于《Scientific Reports》的研究中，Laura A.E. Brunmaier和Travis W. Walker团队针对这一挑战，开发了一套系统化的方案，成功实现了人脐静脉内皮细胞(HUVEC)向无血清化学限定培养基的平稳过渡。研究人员重点关注了适应策略和细胞外基质(ECM)涂层的优化，旨在最小化细胞应激，同时维持细胞健康和实验可用性。

研究团队采用的关键技术方法包括：比较直接适应(DA)与逐步适应(GA)两种细胞适应策略；使用纤维连接蛋白、层粘连蛋白和胶原蛋白IV等多种细胞外基质涂层改善细胞贴附；应用基于人工智能的图像分析工具Trainable Weka Segmentation进行细胞融合度(ξ)的客观量化评估；所有实验均使用从Lonza公司购买的汇合人脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行，并设置了严格的无菌培养条件。

评估细胞对化学限定培养基的反应

研究人员首先比较了不同适应方法下细胞的耐受性。直接适应(DA)组细胞在完全CD培养基(x_CD=1)中培养5天后出现显著脱落，而逐步适应(GA)组细胞则表现出更好的形态保持和贴附能力。通过测量细胞融合度(ξ)发现，GA3方法（从x_CD=0.50开始逐步增加）效果最佳，细胞在5天后仍能维持接近0.8的融合度，且形态正常。

HUVEC向化学限定培养基的适应

当CD培养基比例较高时(x_CD=0.90)，研究人员测试了不同细胞外基质涂层对细胞贴附的影响。结果显示，所有涂层（胶原蛋白IV、层粘连蛋白和纤维连接蛋白）均能改善细胞贴附，24小时后的融合度均超过0.90。然而，在完全CD条件下(x_CD=1)培养5天后，只有纤维连接蛋白涂层能维持正常的内皮细胞形态，而其他涂层组细胞出现纺锤样形态改变。

特别值得注意的是，在纤维连接蛋白涂层上适应完全的CD培养基后，HUVEC在传代后仍能保持增殖能力。细胞在传代后1天达到ξ=0.52，3天后增至ξ=0.67，表明细胞在经历短暂的潜伏期后已完全适应无血清环境。

该研究的结论部分强调，通过优化的逐步适应策略(GA5)结合纤维连接蛋白涂层，能够在五个传代周期内成功将HUVEC从含血清培养基过渡到完全化学限定培养基。虽然完全适应后细胞增殖速度和融合度略有下降，但细胞能保持正常的内皮细胞形态和功能。

这项研究的意义在于提供了一套标准化、可重复的无血清细胞培养方案，为药物开发、疾病模型构建和组织工程等领域提供了更可靠的技术平台。特别是使用重组人 albumin替代传统牛血清 albumin(BSA)，进一步提高了培养基的化学成分明确性和转化应用潜力。未来研究将聚焦于优化生长因子组合，并通过血管形成实验、一氧化氮产生量和标志物表达分析等功能性实验，进一步验证适应后细胞的生物学特性。