表达气味受体的无水存活细胞系在干燥储存后展现气味响应：迈向便携式生物传感器的关键一步

细胞基嗅觉传感器因需持续实验室条件而难以便携应用。本研究利用源自耐干摇蚊的Pv11细胞系，稳定表达了果蝇气味受体DmOr47a、共受体DmOrco及钙敏荧光蛋白GCaMP6f。干燥储存后，细胞不仅存活，且在复水后能响应配体乙酸戊酯，首次证明跨膜蛋白可在异源细胞培养系统中干态保存，为开发便携式生物传感器奠定了基础。

　　

嗅觉系统以其高选择性和灵敏度识别气味分子，使得利用嗅觉受体（Odorant Receptors, ORs）开发气味识别设备备受关注。昆虫嗅觉受体属于配体门控离子通道（Ligand-gated ion channel, LIC）类型，仅需表达两种膜蛋白——特异性气味受体和嗅觉受体共受体（Orco）即可响应气味分子，比脊椎动物的G蛋白偶联受体（GPCR）系统更为简单。尽管已有研究在多种细胞系中成功表达昆虫ORs并评估其对气味的响应，但细胞培养需持续维持水相培养基和狭窄温度范围，限制了其室外应用和设备便携性。

为解决这一难题，研究人员将目光投向了具有强干燥耐受性的细胞系。Pv11细胞源自耐干摇蚊Polypedilum vanderplanki幼虫，该幼虫可通过一种称为无水存活（anhydrobiosis）的代谢停滞状态抵御几乎完全干燥。类似地，Pv11细胞在浓海藻糖溶液中诱导48小时后，也能耐受干燥，并在室温干燥状态下储存超过一年。此前，该细胞系已成功表达外源荧光素酶并干态保存，但功能性膜蛋白如ORs能否在干燥Pv11细胞中保存尚未可知。

本研究旨在验证功能性ORs能否在Pv11细胞表面干燥保存。研究人员选择果蝇Drosophila melanogaster的气味受体DmOr47a，因其与P. vanderplanki系统发育关系相近且配体特征明确。利用钙敏荧光蛋白GCaMP6f评估受体功能：配体结合后，通道复合物打开导致Ca²⁺内流，触发依赖于细胞内Ca²⁺浓度的荧光信号。通过CRISPR/Cas9系统结合精确整合靶染色体（CRIS-PITCh）方法，将GCaMP6f、DmOrco和DmOr47a基因敲入Pv11基因组中Pv.00443基因下游，该基因由Pv11细胞系中最强的121启动子调控，以实现最大表达水平。由此获得的单克隆细胞系命名为Pv11-00443-Or47a。

基因编辑并未影响Pv11-00443-Or47a的干燥耐受性，复水1小时后存活率达26.9%，与野生型Pv11细胞相当。配体响应实验表明，该细胞系对DmOrco激动剂VUAA1（500 μM）和DmOr47a配体乙酸戊酯（Pentyl acetate, PA，1 mM）均产生剂量依赖性荧光响应，且GCaMP6f定位正确。

干燥储存14天后，复水24小时的细胞恢复了对PA的剂量依赖性响应，EC₅₀为8.1 μM，与干燥前（EC₅₀=3.4 μM）处于同一数量级。复水1小时后，细胞对离子霉素（50 μM）和VUAA1仍有显著响应，表明GCaMP6f和DmOrco部分功能得以保存，且这一响应在翻译抑制剂环己酰亚胺（CHX）存在下依然存在，证明源于干燥保存的蛋白质而非新合成。相反，PA响应在复水1小时后不显著，直至12-48小时才恢复，且依赖于新蛋白质合成。

细胞生长监测显示，复水72小时后开始显著增殖，至144小时达到平台期。响应稳定性在多次干燥-复水循环和长期培养（长达4年）中得以保持，甚至经室温储存3年后仍能成功复水并恢复功能。

主要技术方法包括：利用CRISPR/Cas9和CRIS-PITCh系统进行基因敲入建立稳定细胞系；以GCaMP6f为钙指示剂通过荧光显微成像评估受体功能；采用海藻糖诱导干燥耐受性并进行干燥储存；使用翻译抑制剂环己酰亚胺区分蛋白质保存与新合成作用；通过基因组PCR和测序验证精确整合。

研究结果部分显示：

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  Pv11细胞系稳定表达DmOr47a的建立：成功获得双等位基因整合的单克隆细胞系，证实基因编辑正确且干燥耐受性未受影响。
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  Pv11-00443-Or47a细胞系对PA的剂量响应评估：干燥前及复水24小时后均呈现剂量依赖性响应，EC₅₀值与他表达系统相当。
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  干燥Pv11-00443-Or47a细胞复水24小时后功能完全恢复：剂量响应曲线与干燥前相似，表明传感器功能得以保留。
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  DmOrco和GCaMP6f在干燥储存后部分保留功能：复水1小时后对VUAA1和离子霉素的响应证实膜蛋白DmOrco和胞内蛋白GCaMP6f的干燥保存。
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  复水后对PA的响应依赖于新蛋白质合成：复水24小时后PA响应恢复，但CHX处理抑制此恢复，表明DmOr47a需新合成。
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  复水后的配体响应和细胞生长：PA响应于复水12小时后显著，48小时内稳定，随后细胞增殖可能影响响应。

结论与讨论部分强调，本研究首次在异源细胞培养表达系统中实现了功能性跨膜蛋白的干燥保存，证实DmOrco可部分耐受干燥过程。尽管DmOr47a功能需新合成恢复，但Pv11细胞系展示了室温干燥储存与运输的潜力，为开发可室外使用的细胞基气味传感器迈出关键一步。当前局限性包括荧光信号较弱、响应变异性及二甲基亚砜（DMSO）溶剂干扰，未来可通过优化表达系统（如利用基因组安全港和强启动子）提升蛋白水平与响应稳定性。最终，这项研究不仅推进了无水存活生物学机制理解，也为便携式生物传感器设计提供了创新材料。