EHE细胞培养模型的建立为血管肉瘤机制研究与治疗探索提供新平台

本研究针对缺乏人类上皮样血管内皮瘤(EHE)细胞系的难题，开发了EHE扩展原代细胞培养方法。研究人员通过多组学分析和功能验证，证实该模型重现了EHE的关键特征，包括TAZ-CAMTA1融合蛋白表达、锚定非依赖性生长等表型。研究还发现细胞外基质(ECM)和谷胱甘肽代谢通路在EHE中的重要作用，并证明TEAD抑制剂可有效抑制EHE细胞增殖。该模型为这种难治性血管肉瘤的机制研究和药物筛选提供了重要工具。

　　

在血管源性肿瘤研究领域，上皮样血管内皮瘤(Epithelioid Hemangioendothelioma, EHE)一直是个棘手的难题。这种罕见的血管肉瘤具有独特的分子特征——由TAZ-CAMTA1(TC)或YAP-TFE3(YT)融合蛋白驱动，但却缺乏可靠的人类细胞系模型，严重阻碍了对其发病机制的深入理解和有效治疗方案的开发。

目前，EHE的治疗面临重重挑战。虽然手术是局限性病变的首选方案，但对于进展性或转移性EHE，尚无公认的最佳化疗方案。超过50%的患者会发展为转移性疾病，严重影响总体生存期。由于缺乏适当的人类细胞模型，研究人员不得不依赖工程化的小鼠细胞系或人类细胞系来表达这些融合蛋白，但这些模型无法完全模拟人类EHE的复杂性。

为了突破这一瓶颈，爱荷华大学病理学系的Munir R. Tanas教授团队开展了一项创新性研究，成功建立了EHE扩展原代细胞培养体系。这项发表于《Scientific Reports》的工作，为EHE研究提供了前所未有的实验平台。

研究人员从EHE生物样本库中获取肿瘤样本，通过胶原酶/分散酶处理和组织块贴壁法，成功从迁移出的细胞中建立了单层培养体系。他们采用整合的多组学方法对这些培养物进行了全面表征，包括全基因组测序(WGS)、批量RNA测序和单细胞RNA测序等技术。特别值得一提的是，所有样本均来自女性患者，主要源于肝脏或肺部，其中EHE 036为转移性样本，其余为原发性肿瘤。

生成EHE扩展原代细胞培养物

研究团队成功建立了四个EHE扩展原代细胞培养系(EHE 001、036、053和061)。组织学分析显示典型的上皮样细胞排列成索状结构，嵌入黏液样透明基质中。CAMTA1的免疫组化表达支持EHE的诊断，因为CAMTA1正常情况下主要在中枢神经系统组织中表达。

通过RT-PCR和锚定多重PCR，研究人员确定了WWTR1-CAMTA1基因融合的RNA断点。例如，EHE 001显示WWTR1的外显子2与CAMTA1外显子9中部框内融合，产生框内转录本。定量RT-PCR分析显示，在人肺动脉内皮细胞(HPAEC)对照中未检测到融合转录本表达，而在各自的EHE培养物中均有扩增。

单细胞RNA测序数据显示，76%的细胞表达CAMTA1(作为融合基因表达的替代指标)，大多数不表达CAMTA1的细胞属于转录活性低的衰老细胞群体。内皮分化标志物FLI1在细胞中弥漫性表达，与EHE细胞的内皮分化一致。

Western blot分析显示，在四个EHE扩展原代细胞培养物中，而非HPAEC中，存在分子量约170-180 kDa的融合蛋白表达，这与TAZ-CAMTA1融合蛋白的预期大小一致。

EHE细胞培养物显示体外转化表型并对TEAD抑制剂有反应

功能实验表明，所有四种EHE细胞培养物均显示比HPAEC对照更强的增殖能力。在聚HEMA涂层板上进行的锚定非依赖性生长实验中，EHE培养物能形成球形结构并持续增殖，而HPAEC对照在10天后无存活细胞。

软琼脂实验中，所有EHE细胞培养物均能形成集落，而HPAEC细胞不能增殖。EHE 001形成的集落数量和大小均最大，其次是EHE 061，EHE 036和EHE 053形成的集落较少且较小。

研究人员测试了TEAD抑制剂对EHE细胞的效果。泛TEAD抑制剂VT-107能以浓度依赖的方式抑制所有四种EHE扩展原代细胞培养物的增殖，在1μM浓度下可减少30%的增殖。在软琼脂实验中，不同细胞系对VT-107的反应存在差异：EHE 001和EHE 053在低浓度下敏感性较低，而在生理可达剂量1μM下集落形成减少约20%；EHE 036和EHE 061在同一浓度下集落形成减少近80%。相比之下，TEAD1选择性抑制剂IK-930对增殖无显著影响，但能抑制软琼脂中的锚定非依赖性生长。

EHE扩展原代细胞培养物显示少量基因组改变

全基因组测序分析显示，EHE样本平均每兆碱基有0.29个突变，相对其他癌症类型基因组改变较少。基因本体(GO)细胞组分通路富集分析显示，与细胞外基质相关的本体论显著富集。值得注意的是，在所有原代细胞培养物的黏蛋白家族基因中均发现单核苷酸变异(SNV)，这一发现在EHE中尚未有报道。

拷贝数变异(CNV)分析显示，各细胞系间存在共享的和独特的CNV。对34个共享CNV的GO分子功能通路富集分析显示，与谷胱甘肽代谢相关的通路富集。与ECM相互作用相关的基因(MUC3A、MUC12和COL23A1)和谷胱甘肽代谢相关基因(GSTM1和GSTM2)的CNV，提示这些基因在EHE发病机制中的潜在作用。

EHE原代细胞培养物具有相似的转录组

单细胞RNA测序饱和分析显示，在每个条形码(细胞)读取深度为20,000时，检测到多达4,000个独立基因，且无明显平台期，这与TAZ-CAMTA1引起的超转录表型一致。

批量总RNA测序的主成分分析(PCA)显示，EHE 001、036、053和061的技术重复样本聚集在一起，表明它们具有相似的转录组。同时，原代EHE培养物的转录组与HPAEC原代细胞不同，表明EHE培养物表达的转录组并非简单重现内皮细胞特征。

iPathway guide分析显示，EHE细胞培养物和供体肿瘤中关键癌症通路均被激活，包括PI3K-Akt信号、ECM受体相互作用、Hippo信号通路、癌症中的蛋白聚糖和黏着斑，表明EHE原代细胞培养物重现了EHE肿瘤转录组的关键组成部分。

EHE原代细胞培养物的组成

随着连续传代，研究人员观察到EHE扩展原代细胞培养物的传代间隔时间增加，同时增殖能力下降，这与衰老细胞相关的海弗利克极限一致。P20细胞中β-半乳糖苷酶表达增加，p16表达随传代增加而增加，均符合衰老特征。

单细胞RNA测序数据揭示EHE 001扩展原代细胞培养物可分为四个不同的群体：簇1(细胞周期进程和细胞分裂相关基因富集)、簇2(细胞迁移和血管发育相关基因富集)、簇3(氧化磷酸化相关基因富集，符合衰老细胞特征)和簇4(细胞衰老相关基因富集)。

增殖标志物PCNA和MKI-67在簇1中富集，在簇3和4中基本缺失，表明簇3和4由衰老细胞群体组成。癌症干细胞标志物CD44和LIF在批量RNA测序中上调，且在簇1中存在CD44阳性细胞群体，这一群体随着传代逐渐耗竭。

CDKN2A和TP53的表达水平在P17细胞中均比P6细胞高，符合随着传代次数增加而出现的衰老趋势。衰老和衰老标志物MT-CO3等线粒体基因在簇3和4中表达也升高。

基于这些发现，研究人员提出了一个工作模型：增殖性、干细胞样区室(簇1)成熟为具有内皮分化和迁移等癌症特征的转录组谱的过渡放大样细胞(簇2)。最终，CDKN2A和TP53表达增加，伴随各种线粒体基因上调，形成衰老前和衰老细胞(簇3和4)。

研究结论与意义

本研究建立的EHE原代细胞培养模型在基因组、转录组和功能水平上重现了EHE肿瘤的关键特征，为这种难治性血管肉瘤的机制研究和治疗开发提供了宝贵平台。这些培养物不仅证实了TAZ-CAMTA1融合蛋白的表达，还展示了与临床EHE肿瘤一致的增殖特性、锚定非依赖性生长和对TEAD抑制剂的反应。

特别值得注意的是，研究首次在EHE中报道了黏蛋白基因突变，这可能与EHE显著的细胞外基质特征和免疫逃避机制有关。同时，谷胱甘肽代谢通路相关基因的拷贝数变异，为EHE的代谢靶向治疗提供了新思路。

单细胞RNA测序分析揭示了EHE肿瘤内部的细胞异质性，识别出了增殖性干细胞样群体、分化群体和衰老群体，为了解EHE肿瘤生物学提供了新的维度。尽管这些扩展原代细胞培养物最终会进入衰老，但它们作为研究平台的价值已经得到充分证明。

该研究的局限性在于目前仅成功建立了TAZ-CAMTA1驱动的EHE原代细胞培养物，未来需要开发更多永生化人类EHE细胞系，包括YAP-TFE3驱动的细胞系。此外，不同细胞系对TEAD抑制剂反应的差异机制也值得进一步研究。

总体而言，这项研究填补了EHE研究领域的关键空白，建立的人类EHE细胞模型将极大推动对该疾病发病机制的理解和治疗策略的开发。随着更多EHE细胞模型的建立和优化，我们有理由相信，对这种难治性肉瘤的有效治疗方法将不断涌现。