代谢干扰化学物通过诱导人肝细胞HepaRG中细胞色素P450酶活性干扰代谢稳态的机制研究

本刊推荐：为解决代谢干扰化学物(MDCs)如何通过调控细胞色素P450(CYP)酶活性影响代谢稳态的问题，研究人员采用人源肝细胞模型HepaRG，首次系统评估了6种MDCs对CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4的功能诱导作用。研究发现除三氯生(TCS)外，其余MDCs均能显著诱导关键CYP酶活性，揭示了MDCs干扰内分泌代谢的新机制，为安全性评价提供了重要实验依据。

　　

随着工业化进程加速，人类暴露于外源性化学物的风险日益增加，其中代谢干扰化学物(Metabolism Disrupting Chemicals, MDCs)作为内分泌干扰物的一个重要亚类，能够促进代谢改变并导致人类代谢紊乱。全球肥胖和代谢性疾病的大流行不仅与遗传因素、久坐生活方式和营养因素有关，更与这些环境化学物的暴露密切相关。然而，关于MDCs如何通过调控代谢酶功能干扰内源性代谢平衡的机制研究仍存在重大空白。

细胞色素P450(Cytochrome P450, CYP)酶系作为肝脏中最重要的代谢酶系统，不仅负责外源性物质的生物转化，还催化许多内源性代谢反应，包括类固醇激素代谢、脂肪酸氧化和维生素代谢等关键生理过程。因此，CYP酶功能的任何调制都可能影响机体稳态，导致不良健康结局。在功能水平上，MDCs对人类CYP活性的影响很大程度上尚未探索。

为了解决这一关键问题，由法国图卢兹大学毒理学研究所Daniel Zalko教授领衔的国际研究团队在《Toxicology》杂志上发表了一项开创性研究。研究人员利用人肝细胞系HepaRG这一成熟的体外模型，首次系统评估了6种典型MDCs（双酚A(BPA)、全氟辛酸(PFOA)、三丁基锡(TBT)、滴滴涕代谢物(p,p’-DDE)、三氯生(TCS)和磷酸三苯酯(TPP)）对三种主要CYP酶（CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4）活性的诱导作用。

研究采用的关键技术方法包括：基于HepaRG细胞的CYP酶诱导测试方法（遵循EURL ECVAM TM2009-14标准操作程序）、细胞毒性检测（CellTiter-Blue?细胞活力测定）、LC-MS/MS质谱分析（使用Shimadzu 8045三重四极杆质谱仪）以及蛋白含量定量（微BCA蛋白测定法）。研究人员使用三种不同批次的HPR116细胞（分化的HepaRG细胞）进行生物学重复实验，通过特异性探针底物（苯乙醚用于CYP1A2、安非他酮用于CYP2B6、咪达唑仑用于CYP3A4）的代谢产物定量来评估酶活性。

3. Results

3.1. LC-MS/MS method

研究人员成功开发并优化了LC-MS/MS方法，用于同时定量三种CYP探针底物的代谢产物：对乙酰氨基酚（acetaminophen，CYP1A2活性标志物）、羟基安非他酮（hydroxybupropion，CYP2B6活性标志物）和1′-羟基咪达唑仑（1′-hydroxymidazolam，CYP3A4活性标志物）。该方法在线性范围、精密度和准确度方面均符合分析要求，最低定量限(LLOQ)达到0.89-1.56 μg/L，能够满足细胞培养介质中代谢产物的检测需求。

3.2. CYP induction of positive controls

阳性对照化学品（β-萘黄酮用于CYP1A2、苯巴比妥用于CYP2B6、利福平用于CYP3A4）在所有测试板中均显示出特异性诱导作用，酶活性诱导倍数均大于2倍，验证了测试系统的正常运行。

3.3. CYP enzyme induction of the ten pharmaceutical proficiency chemicals

研究人员首先测试了10种药物 proficiency 化学品，以验证实验方法的可靠性。结果显示，CYP1A2和CYP3A4的分类结果与参考文献100%一致，CYP2B6达到89%的一致性，批次间重现性为86%，符合国际验证要求。

3.4. Solubility and cytotoxicity assays

针对6种MDCs，研究人员首先进行了溶解度和细胞毒性测定，确定了每种化合物的非细胞毒性浓度范围。TBT显示出比其他MDCs更强的细胞毒性，因此其测试浓度范围较低。

3.5. CYP enzyme induction of the six MDCs

这是本研究最核心的发现：除TCS外，所有测试的MDCs均能诱导至少一种CYP酶活性。具体而言：

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  BPA诱导CYP2B6和CYP3A4活性，最高诱导倍数分别达到5倍和9倍
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  PFOA诱导所有三种CYP活性，对CYP2B6的诱导最强（5倍）
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  TBT诱导所有三种CYP活性，在1.14 μM浓度下达到最大诱导效果
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  p,p’-DDE诱导CYP1A2和CYP3A4活性，对CYP3A4的诱导特别显著（7倍）
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  TCS对任何CYP活性均无诱导作用
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  TPP诱导所有三种CYP活性，是CYP1A2的最强诱导剂（4.1倍）

研究人员还计算了F2值（产生2倍诱导的浓度），并根据诱导强度将化学品分类为"不确定"、"弱"、"中等"或"强"诱导剂。TPP被归类为CYP1A2和CYP3A4的"强"诱导剂，PFOA为CYP2B6的"强"诱导剂，p,p’-DDE为CYP3A4的"强"诱导剂。

4. Discussion

研究讨论部分强调了肝脏在异生物质生物转化和消除中的关键作用，以及CYP酶系在内外源代谢中的交叉定位。研究结果支持将CYP酶活性诱导作为不良结局路径(AOPs)中的早期分子关键事件，特别是在内分泌和代谢干扰领域。

值得注意的是，CYP酶的诱导可能通过多种机制导致代谢紊乱：首先，CYP酶负责类固醇激素的代谢，其活性改变可能影响激素平衡；其次，CYP驱动的脂肪酸ω-氧化解耦可能产生活性氧(ROS)和脂质过氧化物，导致内质网应激和肝脏脂质积累；最后，CYP3A4的上调 previously 被提出为胆汁淤积AOP中的关键事件。

与现有文献比较显示，本研究结果与多数已有数据一致。例如，BPA通过PXR诱导CYP3A4活性的发现与Kuzbari等人(2013)在DPX2细胞中的研究一致；PFOA对CYP基因表达的诱导作用与Behr等人(2020)和Louisse等人(2020)的报道相符；p,p’-DDE与CYP3A4活性诱导的关联也在法罗群岛人群研究中得到证实(Petersen et al., 2007)。

5. Conclusions

本研究成功将CYP诱导测试方法的应用范围从药物化学品扩展到环境MDCs，首次系统证明了这些化学物在功能水平上调控关键CYP酶活性的能力。除TCS外，所有测试的MDCs均显示诱导一种或多种CYP活性，揭示了这些化学物干扰代谢稳态的新机制。

这些发现对于理解MDCs的作用模式具有重要意义，为化学物安全评价提供了新的实验依据，并支持在体外测试策略中纳入功能水平的CYP活性评估。该方法也有助于实现减少动物测试的目标，符合欧盟化学品安全评估的发展方向。

研究结果强调，在评估化学物的代谢干扰潜力时，需要考虑其对CYP酶功能的影响，这不仅涉及外源物质的代谢命运，更关系到内源性代谢途径的平衡。这一认识将促进对代谢性疾病环境因素机制的更深入理解，为预防和管理这些疾病提供新的思路。