骨碎补总黄酮通过YAP1/TAZ/HIF-1α通路增强BMSCs成骨与促血管生成能力加速长骨再生

本研究针对骨缺损修复中血管生成-成骨耦联机制不清的难题，探讨了骨碎补总黄酮（TFRD）通过调控骨髓间充质干细胞（BMSCs）旁分泌途径抑制内皮细胞YAP1/TAZ表达，进而激活HIF-1α信号通路促进血管生成的新机制。研究人员通过建立小鼠单皮质胫骨缺损模型，结合micro-CT、免疫荧光染色和细胞功能实验，发现TFRD不仅能直接增强BMSCs的成骨分化能力，还能通过旁分泌作用改善缺氧环境下内皮细胞的迁移、增殖和成管功能。该研究为TFRD的临床应用提供了新的理论依据，发表于《Scientific Reports》。

　　

在骨科临床中，由严重创伤、感染或肿瘤切除导致的骨缺损是常见难题。尽管骨骼组织具有自我修复能力，但大面积缺损或不良微环境常导致愈合延迟甚至骨不连。据统计，中国40岁以上人群骨缺损发生率已达4%，其中5-10%的病例会出现愈合不良，给患者生活质量和医疗系统带来沉重负担。骨再生是一个涉及多种细胞类型相互作用的复杂过程，其中骨髓间充质干细胞（BMSCs）扮演着核心调控角色。它们不仅能直接分化为成骨细胞，还能通过旁分泌机制协调血管生成——这一被称作"血管生成-成骨耦联"的关键生物学事件。近年来，传统中药骨碎补中提取的总黄酮类成分（TFRD）被证实具有促进骨再生的潜力，但其具体作用机制尚不完全清楚。

为了深入探索TFRD促进骨再生的分子机制，研究人员开展了一项系统研究。他们首先通过液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）确认了TFRD的主要活性成分，包括柚皮苷和新橙皮苷等13种黄酮类化合物。随后，研究团队建立了小鼠单皮质胫骨缺损模型，通过micro-CT扫描、组织病理学染色和免疫荧光成像等技术，全面评估了TFRD对骨再生的促进作用。在细胞水平，研究人员从TFRD处理的小鼠中分离BMSCs，分析了其对细胞增殖、成骨分化和旁分泌功能的影响。特别关注了缺氧条件下BMSCs条件培养基对内皮细胞行为的影响，并深入探讨了YAP1/TAZ/HIF-1α信号通路在这一过程中的作用机制。

研究采用的主要技术方法包括：小鼠单皮质胫骨缺损模型建立、micro-CT三维重建与骨参数分析、组织学染色（H&E和Goldner染色）、免疫荧光染色与共聚焦显微镜成像、骨髓间充质干细胞分离与培养、细胞增殖与迁移实验（CCK-8、划痕实验和Transwell实验）、成管形成实验、RNA干扰技术以及实时荧光定量PCR分析。所有动物实验均经中国中医科学院中医药健康产业研究所动物护理与使用委员会批准（批准号：2024008），符合相关伦理规范。

TFRD治疗加速了MTD小鼠的骨再生

通过micro-CT分析发现，与对照组相比，TFRD给药在术后第8天（PSD8）诱导了更多骨痂形成。中、高剂量TFRD治疗显著增加了骨痂中的骨体积分数（BV/TV），而低剂量TFRD也显著提高了BV/TV并降低了骨小梁分离度（Tb.Sp）。H&E和Goldner三色染色结果进一步证实，TFRD应用增加了骨痂中的骨积累和矿化骨量。

TFRD治疗促进MTD小鼠骨再生过程中的成骨作用

免疫荧光成像显示，TFRD应用增加了骨痂中成骨细胞（OSX+）数量和骨桥蛋白（OPN）表达水平。同时，中、高剂量TFRD增加了骨痂中胶原纤维体积和骨钙素（OCN）含量，表明TFRD促进了骨基质矿化过程。

TFRD在缺损修复过程中增强BMSCs的成骨能力

从TFRD处理的小鼠中提取的BMSCs显示，中、高剂量TFRD治疗促进了BMSCs的增殖。碱性磷酸酶（ALP）活性和钙沉积分析表明，TFRD处理组的成骨分化能力显著增强。实时荧光定量PCR分析进一步证实，TFRD处理显著提高了成骨相关基因（ALP、RUNX2和OCN）的表达水平。

TFRD增强骨痂中的血管生成-成骨耦联

深层组织成像显示，TFRD处理显著增加了新形成血管（EMCN+）体积和PRRX1+骨祖细胞数量。空间分布分析表明，中、高剂量TFRD应用显著增加了新生血管周围的PRRX1+骨祖细胞数量，证明TFRD可能增强了内皮细胞与骨祖细胞之间的通讯。

TFRD改善缺损修复过程中BMSCs的促血管生成能力

在缺氧条件下，来自TFRD处理小鼠的BMSCs条件培养基（BMSCs-CM）显著增强了人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的迁移、增殖和成管能力。基因表达分析显示，TFRD处理组中促血管生成基因（VEGFA、Hif-1a、VEGFR2和bFGF）的mRNA表达水平显著高于对照组。

TFRD通过调控BMSCs旁分泌途径抑制YAP1/TAZ表达并促进缺氧条件下内皮细胞HIF-1a表达

与对照组相比，来自TFRD处理小鼠的BMSCs-CM显著降低了YAP1/TAZ靶基因CTGF和CYR61的表达水平，但提高了HIF-1a靶基因VEGFA的表达。免疫荧光结果显示，TFRD处理降低了核内YAP1/TAZ比例，同时增加了HIF-1a表达水平。通过siRNA干扰YAP1和TAZ表达后发现，单独敲低YAP1或TAZ对缺氧条件下内皮细胞HIF-1a表达无影响，但双敲低组HIF-1a表达显著增加，且TFRD处理不能进一步增强这种效应。

TFRD在MTD小鼠缺损修复过程中激活HIF-1a信号并抑制YAP1表达

体内实验进一步证实，TFRD给药降低了骨痂中YAP1表达，但增加了HIF-1a在新形成血管（EMCN+）中的体积。同时，HIF-1a信号下游组分VEGFR2在骨痂和新生血管中的表达也因TFRD应用而增加。

本研究系统阐明了TFRD促进长骨再生的双重作用机制：不仅直接增强BMSCs的成骨分化能力，还通过调控干细胞旁分泌途径间接促进血管生成。具体而言，TFRD诱导BMSCs分泌的血管生成因子抑制了内皮细胞YAP1/TAZ表达，进而激活HIF-1α/VEGF/VEGFR2信号通路驱动血管生成。这一发现不仅拓展了TFRD的临床应用前景，也为骨缺损治疗提供了新的策略方向。

研究的局限性在于尚未明确TFRD诱导的干细胞旁分泌途径中具体哪些生物活性物质参与了间接促血管生成作用。此外，仅采用免疫荧光单一方法检测目标蛋白可能影响结论的准确性。未来研究可通过RNA测序、siRNA和抗体阻断等技术进一步鉴定TFRD介导的间接血管生成中的关键生物活性因子，并采用多种蛋白检测方法验证研究结果。