AI驱动的高通量数字菌落挑选平台实现多模态表型微生物菌株分选

本研究针对微生物表型筛选瓶颈，开发了AI驱动的数字菌落挑选器(DCP)平台。该平台通过微流控芯片实现16,000个皮升级微室的单细胞分隔培养，结合AI图像分析和激光诱导气泡技术，成功筛选出运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)乳酸产量提高19.7%、耐受性增强77.0%的突变株，并发现外膜自转运蛋白ZMOp39x027的关键作用，为加速菌株工程和功能基因发现提供了通用策略。

　　

在微生物细胞工厂的开发过程中，表型筛选始终是设计-构建-测试-学习(DBTL)循环中最耗时费力的瓶颈环节。传统菌落平板筛选方法依赖于群体水平的宏观测量，无法捕捉动态的单细胞行为，也难以发现稀有表型。虽然实验室自动化提高了筛选效率，但这些系统仍然缺乏单细胞分辨率。液滴微流控技术虽然提供了单细胞筛选的解决方案，但存在工作流程复杂、污染风险高、液滴融合等问题。

面对这些挑战，研究人员在《Nature Communications》发表了创新性研究成果，开发了AI驱动的数字菌落挑选器(Digital Colony Picker, DCP)平台，实现了基于生长和代谢表型的自动化高通量筛选。该平台无需琼脂或物理接触，在单细胞分辨率下对微生物克隆进行多模态表型分析。

研究团队运用了多项关键技术：基于微流控芯片的16,000个可寻址皮升级微室系统、AI驱动的图像识别算法(Faster R-CNN和SegNet模型)、激光诱导气泡(LIB)技术、以及自动化单细胞分选和收集系统。其中微流控芯片采用三层结构(PDMS模具层、金属薄膜层和玻璃层)，通过真空辅助单细胞加载和气体间隔隔离确保单细胞培养的独立性。

微室生物反应器增强单细胞培养灵活性

研究团队设计的微室式皮升生物反应器有效解决了传统液滴系统的局限性。通过泊松分布优化单细胞加载浓度(1×10⁶ cells/mL)，确保30%的微室含有单个细胞，仅5%存在多个细胞。采用水饱和蒸汽环境将24小时液体损失率控制在6%以内。荧光示踪实验显示液体更换可在5分钟内完成，COMSOL模拟证实微室内流速近乎为零，避免了微生物损失。

AI驱动的靶标表型微室识别与自动化导出

研究团队开发了AI辅助图像处理流程，采用Faster R-CNN目标检测模型精确定位微室，SegNet语义分割模型划定液体区域。细菌数量识别与实际输入浓度呈线性相关(R²=0.998)。通过"从点到面"策略实现芯片全景成像，每分钟可识别800个微室。

LIB技术将目标微室中的液体以液滴形式推进充满油的主通道，液滴回收效率达97%，96%的微量单克隆在固体琼脂平板上成功生长。

DCP系统的高通量单细胞表型分析与分选

以大肠杆菌为模型，研究人员追踪了500个微室中单克隆形成的动态过程，AI算法成功绘制了70个单细胞微室的时间分辨生长曲线，揭示了微生物在微环境适应中的异质性。

荧光表型分选效率验证显示，在靶标与非靶标比例为1:10和1:100时，分选准确率超过95%。在更具挑战性的1:1000比例下，单轮分选后靶标细胞比例提高至近80%。

基于DCP的高乳酸产量和耐受性运动发酵单胞菌株高通量筛选

研究人员将D系统应用于工业有价值的革兰氏阴性细菌底盘细胞运动发酵单胞菌。通过引入异源LmldhA基因(编码D-乳酸脱氢酶)和乳酸诱导型生物传感器，实现了乳酸生物合成。

经过8小时培养后，微室内细菌数量较低，延长培养至24小时后，细菌数量显著增加至200个，适合进一步分析。单轮DCP筛选后，直接分离出5个潜在靶标菌株，其中S-3菌株的乳酸产量比对照菌株提高了17.3%。

在乳酸胁迫条件(30g/L乳酸钾)下进行又一轮筛选，通过整合生长、代谢和胁迫耐受性的多模态数据，发现大多数微室表现出严重的生长抑制。最终获得的S-3-4菌株是唯一能够在乳酸胁迫下完全消耗葡萄糖的菌株，净乳酸产量比对照提高了19.71%。

发现ZMOp39x027增强乳酸耐受性和生长速率

全基因组测序发现S-3-4菌株存在多个非同义突变，包括ZMOp39x027基因，该基因编码一种外膜自转运蛋白。在野生型ZM4菌株中单独过表达这五个候选基因发现，ZM4(pEZ-39x027)的生长显著增强(p=0.01)，表明ZMOp39x027过表达导致发酵过程中更高的生长速率和改善的发酵效率。

研究结论表明，DCP平台作为合成生物学DBTL循环中测试阶段的创新解决方案，实现了高通量单细胞分辨率表型分析。该平台的单细胞分辨率和AI驱动表型分析与特定诱变方法解耦的设计，使其能够兼容多种菌株开发范式。微流控芯片、人工智能和LIB技术的整合为高通量菌株筛选提供了创新框架。

该研究不仅成功鉴定了具有改良表型的菌株，还增进了对乳酸耐受性遗传基础的理解。ZMOp39x027的发现为细菌膜乳酸转运能力提升提供了新见解，对生物技术应用中提高有机酸耐受性具有重要价值。DCP系统将高分辨率生长监测、高效代谢表型筛选与传统工作流程无缝整合的能力，使其成为具有广泛应用价值的强大工具。