ATG16L1与FIP200及ATG8家族蛋白相互作用的分子机制及其在自噬中的功能研究

《Nature Communications》：Molecular bases of the interactions of ATG16L1 with FIP200 and ATG8 family proteins

本研究揭示了ATG16L1通过其FIP200相互作用区(FIR)不仅直接结合FIP200的Claw结构域，还能作为非典型ATG8相互作用基序选择性识别哺乳动物ATG8家族蛋白。研究人员通过高分辨率晶体结构解析和细胞功能实验，证明ATG16L1与FIP200的相互作用对自噬通量至关重要，为理解自噬调控机制提供了新见解。

　　

细胞自噬是维持细胞内稳态的重要降解过程，其核心环节是自噬体的形成。在这一过程中，ATG12-ATG5-ATG16L1复合体被招募至前自噬体结构是启动自噬的关键步骤。虽然已知FIP200等自噬因子参与这一过程，但ATG16L1与FIP200特异性相互作用的分子机制一直未被阐明。同时，为什么自噬需要采用两种不同的方式来招募ATG16L1复合体也仍是未解之谜。

发表在《Nature Communications》上的这项研究首次揭示了ATG16L1中存在一个FIP200相互作用区(FIR)，该区域不仅能直接结合FIP200的Claw结构域，还能作为非典型的ATG8相互作用基序选择性识别哺乳动物ATG8家族蛋白。研究人员通过解析ATG16L1 FIR与FIP200 Claw及GABARAPL1的高分辨率晶体结构，阐明了这些相互作用的分子机制，并开发出能特异性结合ATG8但不结合FIP200的ATG16L1突变体，通过细胞功能实验证明ATG16L1与FIP200的相互作用对有效的自噬通量至关重要。

研究采用的主要技术方法包括：X射线晶体学解析蛋白质复合物结构（分辨率为1.61?和1.76?）、等温滴定量热法(ITC)测定结合亲和力、尺寸排阻色谱与多角度光散射分析蛋白质相互作用、荧光偏振结合实验、核磁共振波谱验证相互作用、免疫共沉淀和蛋白质印迹分析细胞水平的功能。

生化表征ATG16L1与FIP200 Claw的相互作用

研究发现ATG16L1(78-247)片段能与FIP200 Claw直接相互作用，形成化学计量比为2:2的稳定复合物。序列比对分析显示，ATG16L1(235-247)区域符合FIP200 Claw结合FIR基序的特征。荧光偏振实验证实ATG16L1 FIR与FIP200 Claw的结合解离常数(K_d)约为1.33μM，而去除FIR基序则完全破坏了这种相互作用。

ATG16L1 FIR/FIP200 Claw复合物的整体结构

研究人员成功解析了分辨率为1.61?的ATG16L1 FIR/FIP200 Claw复合物晶体结构。该结构显示两个ATG16L1 FIR分子与一个FIP200 Claw二聚体形成2:2化学计量比的异源四聚体。每个ATG16L1 FIR分子形成短β链，以反平行方式增强FIP200 Claw的β4链。

ATG16L1 FIR与FIP200 Claw的结合界面

结构分析显示，ATG16L1的I240侧链深插入由FIP200的C1565、A1567、F1574和F1582形成的疏水口袋，而D238、D239和E241等酸性残基与FIP200的K1568、K1569和R1573形成氢键和电荷相互作用。点突变实验证实这些关键界面残基对相互作用至关重要。

ATG16L1与ATG8家族蛋白相互作用的生化表征

研究发现ATG16L1 FIR能直接与六种哺乳动物ATG8成员相互作用，其中与GABARAPL1和LC3C的结合最强(K_d分别为4.59μM和6.27μM)。含有FIR的ATG16L1片段能与GABARAPL1特异性结合，而去除FIR则完全破坏这种相互作用。

ATG16L1 FIR与GABARAPL1复合物的结构

分辨率为1.76?的晶体结构显示，ATG16L1 FIR以延伸构象占据GABARAPL1的经典AIM结合沟槽。ATG16L1的I243与GABARAPL1的K48和L50形成三个主链氢键，而I240和V242侧链与GABARAPL1的疏水沟槽相互作用。与已知的非经典AIM基序不同，ATG16L1 FIR的第三个残基是酸性Glu残基，直接参与相互作用。

FIP200、GABARAPL1和WIPI2与ATG16L1的结合关系

研究发现FIP200 Claw和GABARAPL1在结合ATG16L1时相互竞争，而FIP200 Claw能与WIPI2和ATG16L1(207-247)形成稳定的三元复合物，表明WIPI2和FIP200可同时结合ATG16L1。

理性设计选择性ATG16L1突变体

基于FIR和AIM基序的序列相似性，研究人员设计了ATG16L1 D239R/I240F(DRIF)双突变体，该突变体能良好结合大多数ATG8家族蛋白但不结合FIP200。同时获得的ATG16L1 I240Q/I243Q(IQIQ)双突变体则完全丧失与两者的结合能力。

ATG16L1 FIR在经典自噬中对自噬通量的重要作用

细胞实验表明，虽然ATG16L1 DRIF和IQIQ突变不影响饥饿诱导的LC3B脂化，但显著损害p62的降解。特别是DRIF突变对p62降解的阻碍更为严重，提示ATG16L1 FIR与FIP200的相互作用促进自噬通量，而与ATG8家族蛋白的相互作用可能抑制自噬过程。

研究还发现，在单膜ATG8连接(CASM)过程中，ATG16L1 DRIF突变显著促进单霉素诱导的LC3B脂化，而单霉素处理显著削弱了ATG16L1与内源性FIP200的相互作用，表明ATG16L1与FIP200的相互作用抑制CASM，而与ATG8家族蛋白的相互作用促进该过程。

这项研究不仅揭示了ATG16L1与FIP200及ATG8家族蛋白相互作用的精细分子机制，还通过巧妙的突变体设计厘清了这两种相互作用在自噬中的不同功能。研究提出的正反馈环路模型为理解自噬体的快速形成提供了新框架，对深入探究自噬调控机制及其在疾病中的作用具有重要意义。