双配体工程化外泌体调控WNT信号通路激活促进肝脏修复与再生

本研究针对WNT信号通路激活疗法在肝脏再生医学中的应用瓶颈，开发了携带WNT3A和RSPO1的双配体工程化外泌体(exoWNT3A/RSPO1)。该载体成功解决了天然WNT配体疏水性导致的递送难题，在急慢性肝损伤和衰老模型中均展现出强大的肝细胞增殖促进和组织修复功能，并通过PPARα信号通路协同调控肝祖细胞命运，为再生医学提供了创新性治疗策略。

　　

肝脏作为人体内具有卓越再生能力的器官，即使在切除70%组织后仍能完全再生。WNT/β-catenin信号通路在这一过程中发挥着关键作用，但在再生医学中的应用一直面临重大挑战——如何将具有受体特异性的WNT配体精准递送至靶组织？天然WNT蛋白存在疏水修饰，难以大规模生产且作用范围受限；而小分子GSK3β抑制剂虽然能强烈激活WNT通路，却会产生多效性毒性并忽略非经典WNT通路的功能贡献。

近日发表于《Nature Communications》的研究突破性地开发了双配体工程化外泌体技术平台。研究人员通过跨膜蛋白WLS（Wntless）实现了所有19种人源WNT配体的主动装载，并首次发现RSPO1蛋白也能自然负载于外泌体。这种双配体外泌体(exoWNT3A/RSPO1)不仅能协同激活WNT信号，更重要的是能保护配体免受WNT拮抗剂（如DKK1、WIF1等）的抑制，为治疗应用扫除了关键障碍。

研究采用多技术联用策略：通过EXODUS超滤系统实现外泌体的高纯度制备；利用STORM超分辨显微技术和免疫金标记证实双配体共定位；采用Axin2-mGFP报告基因小鼠模型进行体内信号激活验证；通过单细胞RNA测序分析转录组变化；建立APAP（对乙酰氨基酚）和CCl₄（四氯化碳）诱导的急慢性肝损伤模型以及衰老模型进行功能评估。

工程化外泌体成功装载WNT和RSPO配体

研究人员发现WLS能与所有19种WNT配体相互作用，将其有效装载到外泌体表面。exoWNT3A^WLS在TOPFlash报告基因检测中显示出与重组蛋白相当的信号激活能力，且能抵抗大多数WNT拮抗剂的抑制作用。令人惊讶的是，RSPO1也能自然负载于外泌体（exoRSPO1），且与exoWNT3A^WLS联合使用时产生显著的协同效应，显著增强β-catenin蛋白的活化和下游基因AXIN2、CCND1的表达。

双配体外泌体调控肝祖细胞命运

在人多能干细胞衍生的肝内胚层（HE）细胞模型中，exoWNT3A^WLS+exoRSPO1处理能有效诱导肝祖细胞（LPC）状态，表现为LGR5和MYC基因上调以及肝母细胞标志物AFP、ALB和HNF4α的表达增加。转录组分析揭示WNT信号通路和过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号通路共同参与这一过程。使用PPARα抑制剂GW6471处理可阻断LPC诱导，表明PPAR信号位于WNT信号下游发挥作用。

单外泌体双配体实现高效信号激活

研究人员进一步开发了同时携带WNT3A和RSPO1的双配体外泌体(exoWNT3A/RSPO1)。质谱分析显示外泌体上WNT3A与RSPO1的比例约为1:2，这种配置能产生超强的WNT信号激活效果，其活性甚至超过小分子抑制剂CHIR99021（3μM）。在肝类器官培养中，exoWNT3A/RSPO1处理不仅诱导WNT通路基因表达，还显著促进类器官生长，转录组分析显示RAS-MAPK信号和细胞周期通路基因显著富集。

体内高效递送与信号激活

静脉注射后，外泌体主要富集在肝脏，并被肝细胞（ALB⁺）和巨噬细胞（F4/80⁺）等多种细胞类型摄取。在Axin2-mGFP报告小鼠中，exoWNT3A/RSPO1处理显著增强中央静脉周围AXIN2⁺肝细胞的信号活性，并增加Zone 3谷氨酰胺合成酶（GS⁺）肝细胞数量。长期安全性评估显示，每周给药一次连续三个月未观察到明显病理变化。

急慢性肝损伤修复效果显著

在APAP诱导的急性肝损伤模型中，exoWNT3A/RSPO1治疗显著减少坏死组织，降低血清ALT和AST水平，恢复肝脏分区标志物（CYP2E1和GS）表达。早期时间点分析显示，外泌体处理能减少TUNEL⁺凋亡细胞并增加Ki67⁺增殖细胞。在原发性人肝细胞（PHH）培养中，exoWNT3A/RSPO1直接促进肝细胞增殖。在CCl₄诱导的慢性肝损伤干预研究中，外泌体治疗同样能减少纤维化瘢痕，改善肝功能指标，并上调PPAR信号通路。

逆转肝脏衰老表型

在18月龄老年小鼠中，exoWNT3A/RSPO1处理显著减少多倍体肝细胞和衰老相关β-半乳糖苷酶阳性细胞，增加Ki67⁺增殖细胞，降低p16和p21衰老标志物表达。转录组分析显示，经外泌体处理的老年肝脏基因表达谱更接近于年轻肝脏，肝功能相关基因上调而衰老相关标记下调。

该研究不仅提供了新型外泌体平台技术，还系统证明了WNT信号激活在多种肝脏病理条件下的治疗潜力。双配体工程化外泌体通过协同激活WNT和PPAR信号通路，促进肝细胞增殖、减少细胞死亡、恢复肝脏分区和功能，为肝脏再生医学提供了具有临床转化前景的创新策略。这种平台技术也可扩展至其他WNT配体的功能筛选和组织特异性再生治疗研究。