HAND2入侵核仁凝聚体开创心脏起搏细胞特异性基因程序的新机制

本研究针对转录因子如何突破核仁相关染色质域(NADs)的异染色质屏障这一关键问题，揭示了HAND2通过定位至核仁凝聚体，结合CAGCTG E-box基序，开创性地激活埋藏在NADs中的心脏起搏细胞特异性基因程序。该发现不仅阐明了心脏起搏细胞重编程的新机制，更提出了转录因子通过入侵特定核内区室激活谱系特异性基因的普适性策略。

　　

在细胞命运决定过程中，转录因子如何突破异染色质的重重屏障，激活特定基因程序，一直是发育生物学领域的核心问题。核仁，这个细胞核内负责核糖体组装的重要工厂，其周围环绕着被称为核仁相关染色质域(Nucleolus-Associated Domains, NADs)的转录抑制区域。有趣的是，NADs中埋藏着许多与细胞类型特异性分化相关的基因，但转录因子如何"闯入"这些高度压缩的染色质区域并启动基因表达，机制尚不明确。

近年来，生物分子凝聚体(biomolecular condensates)的概念为理解细胞内无膜区室的形成和功能提供了新视角。这些通过液-液相分离(liquid-liquid phase separation, LLPS)形成的凝聚体能够富集特定分子，从而高效调控生化反应。然而，转录因子是否以及如何利用已有的核内凝聚体（如核仁）来激活异染色质中的基因，仍是一个待解之谜。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，Kartik Kulkarni等研究人员利用心脏起搏细胞重编程这一独特模型，发现转录因子HAND2能够特异性地定位到核仁中，并结合核仁异染色质中的特定序列，从而激活心脏起搏细胞特异性基因程序。这一发现不仅揭示了心脏发育的新机制，也为理解转录因子如何利用核内区室化调控基因表达提供了全新视角。

研究人员主要运用了几项关键技术：利用心脏起搏细胞重编程模型（通过GHMT转录因子组合将小鼠胚胎成纤维细胞重编程为起搏样细胞），结合活细胞成像、染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)、ATAC-seq（检测染色质可及性）、RNA-seq（转录组分析）和NAD-seq（分析核仁相关染色质域）等多组学方法，以及体外液-液相分离实验和电泳迁移率变动分析(EMSA)等生物化学手段。

HAND2独特定位于核仁

研究人员首先发现，在GHMT（Gata4、HAND2、Mef2c、Tbx5）这组心脏重编程因子中，只有HAND2特异性地定位在核仁，而其他因子则分散在整个细胞核中。这种定位模式在多种细胞类型（包括HEK细胞、新生大鼠心室肌细胞和小鼠心肌细胞）中均得到验证，并且内源性HAND2在窦房结祖细胞中也显示核仁定位，表明这是一种具有生物学意义的特异性分布。

进一步的精确定位显示，HAND2主要位于核仁的周边区域，与核糖体DNA位点没有重叠，也不影响rRNA表达，排除了其直接参与核糖体生物发生的可能性。更重要的是，研究人员发现小鼠胚胎成纤维细胞的NADs中富集了与心脏起搏功能相关的基因，而成功重编程的起搏细胞中HAND2的核仁定位依然存在，提示HAND2的核仁定位与起搏细胞基因激活之间存在功能联系。

起搏细胞谱系转化需要HAND2的核仁定位

为了区分HAND2核仁定位的功能意义，研究人员巧妙地设计了两类功能分离突变体：ND+突变体（丧失核仁定位但保留DNA结合能力）和N+D-突变体（保留核仁定位但丧失DNA结合能力）。这些突变体在蛋白结构和二聚化能力上保持正常，但特异性地影响某一功能。

令人惊讶的是，虽然两种突变体都能激活一些一般的心脏基因（如Tnnt2），但只有野生型HAND2能够有效促进心脏起搏细胞重编程，诱导Hcn4表达和起搏细胞特征的形成。ND+突变体（无法定位核仁）完全丧失了激活起搏细胞基因的能力，而N+D-突变体（无法结合DNA）也同样失效。这一结果明确表明，HAND2的核仁定位对其激活起搏细胞基因程序至关重要。

HAND2激活区室化的基因程序

通过转录组分析，研究人员发现HAND2依赖的基因程序具有明显的核内区室化特征。具体而言，需要HAND2核仁定位才能激活的基因（簇5）主要富集在离子通道和细胞连接等功能，而这些基因恰好位于NADs中。相反，不依赖核仁定位的HAND2靶基因（簇4）则与一般心脏发育相关，且不位于NADs中。

为了进一步验证这一发现，研究人员将一个异源的核仁定位序列(NoLS)连接到ND+突变体上，成功将其"强行"带回核仁。令人振奋的是，这种改造后的蛋白能够恢复对NADs中起搏基因的激活能力，但同时却削弱了对非NADs基因的激活。这一精巧的实验不仅证实了核仁定位的必要性，还提示HAND2的功能受到其亚核定位的精细调控。

HAND2结合超声抵抗的核仁异染色质

传统的ChIP-seq方法主要检测可溶性染色质（常染色质）中的结合事件，可能会低估转录因子在异染色质中的结合。研究人员通过优化实验方案，成功分离了超声抵抗的异染色质组分（富含核仁染色质），并在此背景下进行了HAND2 ChIP-seq分析。

结果显示，HAND2的结合位点可以分为两大类：位于常染色质的簇A和位于异染色质的簇B。簇B位点具有更高的核仁关联分数，更倾向于位于NADs中，且在重编程前可及性较低。重要的是，只有野生型HAND2能够结合簇B位点，而ND+突变体则完全丧失了这一能力，进一步证实了核仁定位对HAND2结合异染色质的重要性。

HAND2开创核仁异染色质用于谱系特异性基因激活

先锋转录因子(pioneer transcription factors)的定义包括两个方面：结合核小体占据的位点以及启动异染色质向活性状态的转变。研究人员发现，HAND2结合的异染色质位点在GHMT重编程过程中表现出染色质可及性和H3K27ac（活性增强子标记）的显著增加，同时异染色质标记H3K27me3减少。

具体而言，HAND2能够结合并重塑NADs中的三种染色质状态：组成型异染色质、兼性异染色质和沉默染色质，其中对沉默染色质的启动作用最为明显。这些发现表明HAND2符合先锋转录因子的标准，能够结合核小体占据的位点并启动异染色质向常染色质的转变。

HAND2二聚体伙伴决定亚核定位、结合位点偏好和谱系转化效率

有趣的是，HAND2在常染色质和异染色质中偏好不同的E-box基序：在常染色质中偏好CATCTG，而在异染色质中偏好CAGCTG。进一步的研究发现，这种结合偏好与HAND2的二聚化状态密切相关。

HAND2与普遍表达的E12形成的异源二聚体主要位于核质，无法进入核仁，且偏好CATCTG位点。相反，HAND2同源二聚体则能够定位到核仁，并偏好结合CAGCTG位点。体外实验证实，HAND2同源二聚体对CAGCTG的结合亲和力确实高于CATCTG。

更重要的是，当研究人员共表达E12时，HAND2被"拖出"核仁，导致起搏细胞重编程效率显著下降。这一发现不仅证实了核仁定位的功能重要性，还揭示了二聚体伙伴选择在调控转录因子亚核定位和功能中的关键作用。

定量分析显示，在重编程过程中，核仁内的HAND2浓度可达4.3μM，高于其同源二聚体对CAGCTG的平衡解离常数(～1.2μM)。这一浓度效应可能解释了HAND2同源二聚体为何能够在核仁内有效结合低亲和力的CAGCTG位点。

研究结论与意义

本研究系统阐明了HAND2通过定位至核仁凝聚体，以同源二聚体形式结合CAGCTG E-box基序，开创性地激活埋藏在核仁相关染色质域中的心脏起搏细胞特异性基因程序的分子机制。这一发现具有多方面的重要意义：

首先，它揭示了心脏起搏细胞发育和重编程的新机制，为理解心脏传导系统的形成提供了重要线索。其次，它提出了转录因子通过"入侵"特定核内区室（如核仁）来激活异染色质中基因的普适性策略，拓展了对基因表达调控的理解。

从更广泛的视角来看，这项研究表明生物分子凝聚体不仅可以作为激活因子的富集场所（如转录共激活因子凝聚体），也可以被转录因子"劫持"来突破异染色质屏障。这种机制可能普遍存在于各种发育和病理过程中，为理解细胞命运决定和疾病发生提供了新思路。

此外，研究还揭示了二聚体伙伴选择在调控转录因子功能中的重要性。通过选择不同的二聚化伙伴，细胞可以精细调控转录因子的亚核定位和DNA结合特异性，从而实现基因表达的精确时空调控。

最后，将替代命运基因隔离在核仁异染色质中，可能为细胞命运决定提供了额外的调控层面。对于起搏细胞这种表达多种神经元基因的杂交细胞类型而言，将其特异性基因程序储存在核仁异染色质中，既保证了它们在需要时可以被激活，又防止了在其他细胞类型中的异常表达。

总之，这项研究不仅深化了对心脏发育特定过程的理解，更重要的是提出了转录因子通过利用现有核内凝聚体来突破异染色质屏障的普适性机制，为发育生物学和疾病研究提供了新的概念框架。随着对核仁异染色质功能的进一步探索，我们有望揭示更多在发育和病理重编程中发挥作用的关键调控机制。