解析非编码GWAS位点揭示成纤维细胞因果基因在心力衰竭病理生理中的关键作用

本研究通过整合高分辨率3D染色质互作与开放染色质数据，系统解析了心脏疾病GWAS非编码位点的调控机制。团队在人类心室成纤维细胞中构建了全基因组基因调控回路，发现远端靶基因富集于心脏重塑相关通路，并利用CRISPR-Cas9技术验证了CXCL12、FURIN等高优先级靶点的调控功能，为心力衰竭治疗提供新靶点。

　　

心力衰竭作为全球增长最快的公共卫生问题之一，其患病率预计到2030年将增长十倍以上。这种复杂综合征继发于心室充盈或射血功能受损，其特征包括适应性心脏重塑（肥大或扩张伴随心脏纤维化）。心脏成纤维细胞在心力衰竭病理生理中扮演核心角色——这些间充质细胞不仅参与重塑相关的心肌肥大和扩张，还在心肌梗死后通过形成富含胶原的纤维化瘢痕替代死亡心肌细胞。然而，当疾病激活的成纤维细胞过度活跃（肌成纤维细胞化），其过量产生的细胞外基质会导致心肌壁僵硬化。

尽管全基因组关联研究（GWAS）已发现大量与心力衰竭相关的遗传位点，但约80%的显著单核苷酸多态性（SNP）位于基因组的非编码区，其调控机制和目标基因仍不明确。传统表达数量性状位点（eQTL）分析方法因使用混合细胞组织和小样本队列存在局限性，往往导致目标基因误判。近年来染色体构象捕获技术（如Hi-C）虽能鉴定全基因组DNA互作，但多数数据分辨率低或来源于非疾病相关细胞系。

为破解这一难题，研究团队对原发性人类心室成纤维细胞（NHCFV）进行了多组学整合分析。通过高分辨率Hi-C（2-kb）、ATAC-seq和RNA-seq技术，系统构建了心脏疾病GWAS SNPs与目标基因间的全基因组调控回路。研究发现超过三分之二的SNP-基因对涉及远端靶基因，这些基因富集于心脏重塑和心力衰竭相关通路。研究人员进一步利用CRISPR-Cas9技术对优先调控区域进行缺失实验，结合单细胞RNA-seq（Perturb-seq）验证了CXCL12、FURIN等关键靶点的调控关系。

关键技术方法包括：使用Arima Genomics构建原位Hi-C文库（获得近15亿有效互作对）；ENCODE ATAC-seq流程鉴定开放染色质区域（超过25万个共享峰）；HINT算法预测转录因子结合位点（识别840个已知TF的269万个独特 motif）；Chromium 3'V3.1方法进行单细胞Perturb-seq（每个细胞获取75,000条读长）；通过Mixscape算法区分真正扰动细胞。

Characterization of functional genomic features relevant to heart failure and gene regulation

研究人员通过对正常人类心室成纤维细胞（NHCFV）进行深度Hi-C测序，获得近15亿个有效互作对，其中85%为顺式长程互作（≥20-kb）。ATAC-seq鉴定出25万个开放染色质区域，包含TEAD、SMAD等心脏相关转录因子结合位点。RNA-seq证实永生化心脏成纤维细胞（iHCF）与NHCFV具有高度相似性，为后续基因扰动实验提供基础。

Data integration to generate regulatory circuits

通过整合5534个心脏疾病相关SNP位点（涵盖3880个独特SNP）与三维基因组数据，构建了可及SNP与转录起始位点（TSS）的互作网络。约15%的可及SNP与HINT足迹区域重叠，7-9%与已知TF结合位点重叠。GOTHiC和HiCCUPS算法分别识别出3000多个独特SNP-基因对，其中三分之二涉及GWAS未报告的远端靶基因。

SNP-Gene Interactions Involving Known Heart Disease Genes

研究发现rs7772537（心房颤动相关）位于FOXJ3转录因子足迹内，与850-kb外的TBC1D32启动子物理互作；rs1680636（冠心病相关）位于多个TF足迹中，与CXCL12形成200-kb染色质环；rs7549250和rs4129267（心肌梗死相关）位于IL6R内含子区，与20-kb外的启动子互作；rs35346340（冠心病/心肌梗死相关）位于FES基因内含子，但仅与FURIN基因互作。这些互作关系在人类心肌病单核RNA-seq数据中得到验证。

Validation of SNP-function relationships using single-cell profiling of CRISPR-mediated enhancer deletions

通过改良的Perturb-seq方法对四个增强子区域（ER6q22.31、ER10q11.21、ER15q26.1等）进行CRISPR缺失实验。结果显示：ER10q11.21缺失显著下调CXCL12表达；ER15q26.1缺失降低FURIN及其底物MMP2表达；ER6q22.31缺失虽未影响TBC1D32，但下调了心肌收缩关键基因COX7A1。通路分析发现这些扰动影响心脏肌肉收缩、糖尿病心肌病等KEGG通路，并改变纤维化（POSTN、COL1A1）、炎症（CCL2）和肌成纤维细胞（ACTA2）相关基因特征。

研究结论表明，心脏成纤维细胞中非编码GWAS位点通过长程染色质互作调控远端基因表达，这些靶基因富集于心脏纤维化和重塑相关通路。CXCL12（通过ATF3调控）、FURIN（通过EGR1/KLF15/SNAI1调控）等基因的验证为心力衰竭治疗提供了新靶点。该研究首次系统绘制了心脏成纤维细胞的调控回路图谱，证明多组学整合方法能够有效识别疾病相关非编码变异的功能靶标，为复杂疾病的机制解析和治疗开发提供新范式。

研究的局限性包括Hi-C技术对局部基因组结构的解析限制、ATAC-seq对刺激激活增强子的覆盖不足，以及永生化细胞与原代细胞的生物学差异。未来研究需结合更多表观基因组数据（如组蛋白修饰）来深入解析调控方向性。该成果于2025年发表在《Nature Communications》，为心力衰竭的精准治疗奠定理论基础。