阿米巴驱动假丝酵母复合体毒力表型的环境适应性演化

本研究揭示了环境中的棘阿米巴（Acanthamoeba castellanii）与半赤假丝酵母复合体（Candida haemulonii complex）相互作用后，通过诱导真菌形态转换（如平滑-粉色、粗糙-粉色、强粉色及菌丝-白色表型）、显著增强生物被膜（biofilm）形成能力（生物量增加>15倍，胞外基质增加>2.2倍）及上调毒力相关基因（WOR1>2.4倍，CPH1达4.8倍，HGC1>1.9倍，ALS1>3.6倍，BCR1>14.5倍，EGF1>1.6倍），从而显著提高其环境胁迫耐受性和对Galleria mellonella模型的致病力（LD50降低71.5–97.1%），为理解环境压力如何促进真菌病原性进化提供了重要模型。

　　

ABSTRACT

环境中的阿米巴捕食行为能够诱导微生物产生适应性性状，增强其环境抵抗力与致病潜力。本研究探讨了棘阿米巴（Acanthamoeba castellanii）的相互作用是否会调节环境来源的半赤假丝酵母复合体（Candida haemulonii complex）物种的毒力。研究结果揭示，对阿米巴宿主的适应能诱导从甲虫肠道分离的C. duobushaemulonii发生显著的表型变化，产生四种不同的表型：平滑-粉色（smooth-pink）、粗糙-粉色（rough-pink）、强粉色（intense-pink）和菌丝-白色（hyphae-white）。这些变异体表现出聚集性和菌丝形成能力增强。适应阿米巴的分离株产生的生物被膜（biofilm）生物量比未适应分离株高出15倍以上，胞外基质（extracellular matrix）也多出2.2倍以上。转录分析显示，毒力相关基因表达上调，包括双态性调节因子WOR1（>2.4倍）、CPH1（4.8倍）和HGC1（>1.9倍），以及生物被膜相关基因ALS1（>3.6倍）、BCR1（>14.5倍）和EGF1（>1.6倍），证明了阿米巴诱导的致病性状增强。此外，适应过程还增强了真菌对环境胁迫的耐受性，并导致水解酶（包括酯酶、磷脂酶和分泌型天冬氨酸蛋白酶）的分泌增加超过1.3倍。利用大蜡螟（Galleria mellonella）进行的致病性试验显示，适应阿米巴的分离株毒力显著增加，其半数致死剂量（LD₅₀）与未适应对照组相比降低了71.5–97.1%。这些发现表明，与环境中的阿米巴相互作用可以促进C. duobushaemulonii中毒力相关表型的出现，为理解环境压力如何促进真菌致病性提供了模型。

Introduction

真菌毒力的微进化是一个关键研究领域，为了解致病性驱动机制及其对人类健康的潜在影响提供了重要见解。真菌和酵母的各种毒力性状受多种环境压力的调节。这些适应性使生物体能够优化营养获取、逃避捕食、在不同生态环境中建立复制生态位，并最终促进对宿主生物的入侵。值得注意的是，大多数机会性真菌病原体并不直接在人与人之间传播，而是在宿主感染期间持续存在于环境储库中。因此，它们的毒力性状不太可能仅仅在人类宿主体内进化而来。相反，这些性状可能是对环境挑战（如与微生物捕食者的相互作用）的反应而出现的，这些挑战影响了它们的生存、适应能力，并最终导致感染哺乳动物宿主。

假丝酵母（Candida）物种是免疫功能低下个体中最常见的侵袭性感染相关真菌病原体，导致显著的发病率和死亡率。虽然白假丝酵母（C. albicans）是最常见的物种，但非白假丝酵母（non-albicans Candida, NAC）物种，包括热带假丝酵母（C. tropicalis）、克柔假丝酵母（C. krusei）、近平滑假丝酵母（C. parapsilosis）、光滑假丝酵母（C. glabrata）、耳念珠菌（C. auris）、葡萄牙假丝酵母（C. lusitaniae）以及半赤假丝酵母复合体（C. haemulonii complex, CHC）正变得越来越普遍。在过去的几十年里，CHC物种的临床分离率在马来西亚、中国、巴西和美国等几个国家有所上升，中国已报告了令人担忧的暴发事件。此外，CHC物种容易适应环境变化，并经常表现出对多种抗真菌药物（如两性霉素B、唑类和棘白菌素）的体外耐药性。CHC物种作为念珠菌病的病原体出现，引起了广泛关注，促使人们研究其发病机制以及与宿主的相互作用。

与CHC物种相关的毒力因子包括水解酶的产生、表面粘附以及在医院环境中的持久存在能力，这突出了它们水平传播的潜力。涉及这些物种的暴发事件引发了人们对其与耳念珠菌等其他著名病原体在生态和生理学上相似性的担忧。CHC物种的生态适应性，包括它们与环境生物的相互作用，可能有助于其毒力和引起感染的能力。

近年来，对真菌生态学和进化的研究强调了环境相互作用在影响微生物毒力方面的重要性。特别令人感兴趣的是真菌与原生动物（如阿米巴）之间的关系，这些原生动物在多种生态位中无处不在。阿米巴以其对微生物的捕食行为而闻名，已被证明对多种细菌和真菌物种施加选择压力，可能驱动毒力性状的进化。真菌被阿米巴捕食被认为是一种重要的选择压力，可能作为环境真菌的“训练场”。据推测，在病原真菌中发现的许多毒力因子，包括那些与人类疾病有关的毒力因子，最初是作为对阿米巴捕食的适应性反应而进化的。研究表明，新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）与棘阿米巴的相互作用会诱导隐球菌毒力相关性状发生显著改变。这些变化，包括荚膜尺寸增大、黑色素产生增强以及脲酶和磷脂酶等酶的释放，在酵母抵抗阿米巴捕食中起着至关重要的作用。值得注意的是，盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）在吞噬后无法杀死新型隐球菌，这突出了隐球菌发展出了有效的逃避机制。

类似地，格特隐球菌（Cryptococcus gattii）与阿米巴的相互作用导致隐球菌细胞发生表型变化，包括多糖分泌增加、对氧化应激的耐受性增强以及感染小鼠的死亡率升高。其他真菌物种，如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、近平滑假丝酵母和白假丝酵母，在与阿米巴相互作用后也表现出增强的毒力性状。这些性状包括改善的耐热性、菌丝形成、表型转换和抗氧化应激能力。特别令人担忧的是阿米巴能够内化并促进酵母细胞（尤其是像耳念珠菌这样的多重耐药物种）的增殖，这进一步加剧了它们引起严重感染的潜力。

本研究调查腐生性CHC物种与自由生活的阿米巴之间的相互作用是否可能增加真菌毒力。我们假设，在环境中暴露于阿米巴的假丝酵母分离株可能会发展出增强其对阿米巴吞噬抵抗力的适应性，并改善其生存策略。这些修饰可能有助于酵母逃避人类免疫防御，可能导致致病性增加和严重感染。为了证明这一点，我们还使用了大蜡螟幼虫作为感染模型。由于其先天免疫系统与哺乳动物的先天免疫具有相似性，大蜡螟非常适合用于研究真菌发病机制。研究环境捕食者（如阿米巴）如何影响CHC物种的毒力，可能为真菌致病性的生态驱动因素提供有价值的见解，并为未来的感染预防和控制策略提供支持。

Materials and methods

Organisms and culture conditions

棘阿米巴（A. castellanii）菌株30234在先前建立的条件下于PYG肉汤中28°C黑暗保存。常规培养和实验程序遵循标准方案，细胞以贴壁培养物形式生长并相应收获。

半赤假丝酵母复合体的环境分离株按照泰国生物资源研究中心（Thailand Bioresource Research Center, TBRC）、BIOTECH培养物保藏中心（BIOTECH Culture Collection, BCC）提供的方案进行培养。这些分离株来自泰国各地自然栖息地。假丝酵母复合体的培养条件遵循所述方案。菌株最初在沙氏葡萄糖琼脂（Sabouraud dextrose agar, SDA）上28°C培养48小时，然后转移到酵母提取物蛋白胨葡萄糖（Yeast Extract Peptone Dextrose, YPD）琼脂上，条件相同。实验前，收获酵母细胞，用1×PBS洗涤，并使用血球计数器计数。

大蜡螟幼虫来自泰国沙缴府的一个养殖场。它们在人工饲料上于30°C培养箱中维持。每次实验选择十只幼虫，重量约为300–350毫克，颜色清晰均匀，无黑斑或灰色标记，随机分配到对照组和处理组。感染后，幼虫在37°C培养皿中孵育。实验结束后，通过-20°C冷冻24小时处以安乐死。本研究中的所有程序均遵循泰国清迈大学医学院制定的动物实验指南和规定。此外，它们符合泰国国家研究委员会制定的《科学用途动物伦理原则和指南》。该研究遵循ARRIVE指南进行。

Experimental co-adaptation of C. haemulonii species complex with A. castellanii

两种生物之间的实验共适应根据所述方法进行，略有修改。五个分离株的三个生物学重复在YPD琼脂上生长2天，用无菌磷酸盐缓冲盐水（1×PBS, pH 7.2）洗涤，调整至1 × 10⁸ cells/mL，取100 μL稀释的酵母细胞（1 × 10⁶ cells/mL）接种到三个独立的棘阿米巴培养物（1 × 10⁵ cells/mL）中，置于24孔板中的1 mL PBS中，28°C孵育30天。每三天，用0.5% Triton X-100裂解三个重复孔中的阿米巴，并使用27号针头抽吸悬液至少五次。将释放的酵母细胞转移到新的阿米巴平板。作为对照，三个生物学重复的酵母在无阿米巴的PBS中维持，并且每三天也接受0.5% Triton X-100处理。之后，在相互作用3天（第1次传代）、15天（第5次传代）和30天（第10次传代）后收集样品。

将十倍稀释的样品涂布在添加了5 μg/mL 玫瑰红B（phloxine B）的新鲜YPD培养基上，并于28°C孵育。在7天的时间内观察菌落颜色和形态特征，之后选择不同的菌落进行进一步分析。在棘阿米巴存在下生长的酵母细胞被归类为暴露群体，而在棘阿米巴缺失下生长的酵母细胞被定义为非暴露群体。从这些群体中分离出的单个菌落分别被定义为适应和非适应分离株。

Quantification of C. haemulonii species complex viability

为了评估半赤假丝酵母（适应和非适应分离株）被棘阿米巴吞噬后的存活情况，将阿米巴悬浮在PBS中，浓度为1 × 10⁶ cells/mL，将1 mL该悬浮液加入12孔板的每个孔中。以感染复数（multiplicity of infection, MOI）为10（酵母:阿米巴 = 10:1）将半赤假丝酵母引入棘阿米巴培养物中，并在28°C孵育24小时。孵育后，通过用PBS洗涤去除未被吞噬的酵母细胞。收集洗涤液用于酵母细胞的间接定量。为了解离贴壁的阿米巴，将平板置于冰上10分钟。随后通过用27号针头抽吸悬浮液来裂解阿米巴细胞。之后，进行酵母悬浮液的系列10倍稀释。通过将稀释液涂布在SDA上并于28°C孵育24小时来确定酵母细胞活力。通过计数菌落形成单位（colony-forming units, CFU）/mL来量化活力，提供酵母存活的直接测量。

Morphological switching assays

为了研究形态转换，从每次传代（阿米巴暴露群体）和对照组分离菌落，在YPD肉汤中培养，于28或37°C、150 rpm振荡培养2天。孵育后，通过5000 rpm离心15分钟收获酵母细胞，随后用PBS洗涤三次。将细胞浓度调整至1 × 10³ cells/mL。取100 μL该稀释的酵母悬浮液（约含1 × 10² 个细胞）涂布在添加了5 μg/mL 玫瑰红B的YPD琼脂平板上。然后将这些平板在28或37°C孵育7天。之后，记录菌落和细胞形态。通过确定显示替代表型的菌落比例相对于总菌落数来量化形态转换的频率。数据以转换频率百分比表示，并带有相应的标准差。

Aggregation kinetic assay

为了评估暴露于阿米巴的酵母与未暴露酵母的细胞聚集情况。从每次传代和对照组分离的酵母细胞在YPD肉汤中培养。培养物在28°C、连续150 rpm振荡下孵育48小时。然后通过5000 rpm离心15分钟收集酵母细胞，并用PBS洗涤。聚集测定按照所述方法进行，略有修改。制备含有10⁶ cells/mL的酵母悬浮液于1× PBS中，涡旋30秒。然后，取100 μL酵母悬浮液（1 × 10⁵ cells）移液到96孔板的每个孔中。然后将平板在37°C静置孵育30、60、90和120分钟。为了量化聚集，我们使用以下公式计算光密度（optical density, OD）降低的百分比：

[ (OD₀ - OD_f) / OD₀ ] × 100

其中OD₀代表初始OD值，OD_f代表每次孵育期后的OD值。所有测量在530 nm波长下使用BioTek Synergy? H4混合微孔板读数仪进行。不含酵母细胞的PBS用作空白对照。根据计算的聚集百分比，我们将聚集水平分类如下：高（超过40%）、中等（30–40%）和低（低于30%），符合先前的研究。

Biofilm formation assay

Biomass quantification

为了评估阿米巴适应分离株与非适应分离株的生物被膜形成，我们采用了生物被膜形成测定法。半赤假丝酵母分离株在YPD中培养48小时，重悬于RPMI 1640（5 × 10⁴ cells/mL）中，并在96孔板中于37°C孵育24小时。用1×PBS洗涤后，用99%（v/v）甲醇固定生物被膜，用0.05%结晶紫染色30分钟，并再次洗涤。通过用33%（v/v）乙酸溶解染料，然后使用微孔板读数仪在595 nm测量吸光度来量化生物被膜生物量。

Metabolic activity measurement

为了评估生物被膜的代谢活性，进行了比色测定以检测3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）还原为不溶性紫色甲臜产物。简言之，洗涤附着的生物被膜，随后加入50 μL MTT溶液（1 mg/mL）。然后将平板在37°C黑暗孵育4小时。孵育后，小心移除MTT溶液。向每孔加入100 μL 99.5%二甲基亚砜（DMSO）以溶解甲臜产物。将平板在37°C黑暗进一步孵育30分钟。然后在570 nm测量光密度。

Extracellular matrix detection

使用先前描述的方法量化生物被膜胞外基质（ECM）。简言之，生成生物被膜-ECM，未固定的生物被膜进一步用200 μL 0.1%番红精溶液在室温下染色5分钟。然后用1×PBS洗涤孔一次，并使用200 μL 30%乙酸溶解结合的染料。从每孔转移100 μL样品到新的96孔板，使用微孔板读数仪在OD 530 nm测量吸光度。

Tolerance to stressors to environmental factors

酵母细胞悬浮液进行系列稀释，从每个稀释度（10⁵ –10² cells/mL）取3 μL等分试样接种到含有不同浓度环境应激物的YPD琼脂上。为了评估适应的半赤假丝酵母分离株的耐盐性，在添加了0.5 M和1 M NaCl的YPD琼脂上培养。类似地，为了评估对高铁水平的耐受性，在含有100 μM和1,000 μM柠檬酸铁铵的YPD琼脂上培养分离株。此外，将酵母细胞悬浮液涂布在调节至酸性（pH 3.0）和碱性（pH 10.0）条件的YPD琼脂上。将含应激物的平板在28°C孵育2天，孵育后显示生长的分离株分别被归类为耐盐、耐铁、耐酸或耐碱。为了评估热应激，额外的平板在37°C和42°C孵育2天。所有平板随后拍照记录。

Assessment of virulence factors

Hemolytic activity

测试分离株的血溶素产生。从适应和非适应分离株制备含有约1 × 10⁸ cells/mL的接种物。将10 μL每种酵母悬浮液（1 × 10⁶ cells）接种到新鲜绵羊血琼脂平板上。然后将平板在5% CO₂、37°C孵育2天。然后通过透射光观察平板确定溶血活性，阳性活性由菌落周围形成清晰晕圈指示。通过计算菌落直径与溶血区直径的比率来量化溶血活性（Hz）。根据Hz评分，将溶血活性分为四类。

Secreted aspartyl protease activity

通过酵母碳基-牛血清白蛋白（YCB-BSA）方法评估分泌型天冬氨酸蛋白酶（SAPs）活性。适应和非适应分离株在28°C YPD肉汤中培养过夜。然后收获酵母细胞并用PBS洗涤三次。之后，将细胞密度调整至1 × 10⁸ cells/mL。将10 μL酵母悬浮液（含1 × 10⁶ cells）点种在含有酵母碳基（23.4 g/L）和牛血清白蛋白（20 g/L）的YCB-BSA琼脂上，28°C孵育5天。随后用酰胺黑染色溶液对平板染色以可视化沉淀区（Pz），测量这些区域以确定SAPs活性。

Phospholipase activity

按照所述方法研究磷脂酶活性。简言之，将10 μL 1 × 10⁶ 酵母细胞悬浮液接种到补充有58.4 g/L NaCl、5.5 g/L CaCl?和10%卵黄乳液的SDA上。平板在37°C孵育5天。孵育后，测量菌落直径和菌落加沉淀区的直径。通过计算菌落直径与总沉淀区直径的比率确定磷脂酶活性（Pz）。

Esterase activity

按照所述方法进行酯酶活性测定。简言之，从适应和非适应分离株取10 μL酵母悬浮液（含1 × 10⁶ cells）滴加在含有10 g/L蛋白胨、5 g/L NaCl、0.1 g/L CaCl₂、5 mL（v/v）Tween 80、15 g/L琼脂、pH调至6.5的培养基上。平板在37°C孵育5天。通过测量菌落周围的沉淀区确定酯酶活性。

Quantitative RT-PCR (qRT-PCR)

为了研究适应和非适应分离株之间与毒力相关的基因表达，每个分离株在YPD琼脂上培养2天，并用无菌磷酸盐缓冲盐水（1×PBS, pH 7.2）洗涤。将酵母悬浮液调整至浓度为1 × 10⁸ cells/mL，取100 μL该悬浮液（1 × 10⁶ cells/mL）接种到24孔板中的1 mL RPMI-1640培养基中，随后在37°C孵育24小时。然后通过4,500 rpm离心10分钟收获酵母细胞。使用NucleoZOL提取总RNA，并使用0.1 mm玻璃珠在珠磨机中进行细胞破碎。根据制造商的说明完成RNA分离。使用Maxime RT PreMix将1微克总RNA转化为cDNA。使用SensiFAST? SYBR Lo-ROX Kit在7500实时PCR系统上进行定量实时PCR（qRT-PCR）。所选基因的引物序列在补充表S1中提供。qRT-PCR条件为：95°C初始变性60秒，随后进行40个循环的95°C 60秒和60°C 60秒。使用2^?ΔΔCt方法分析基因表达水平，以肌动蛋白（actin）作为参考基因。所有测量在三个独立实验中一式三份进行。

Galleria mellonella pathogenesis model and histopathological findings

G. mellonella killing assays

为了研究适应和非适应分离株的体内致病性，进行了大蜡螟致死试验。使用重量在300至350毫克之间的幼虫进行所有实验。使用在线工具确定样本量，用于比较两个比例的卡方检验（对照存活率=80%，处理存活率=20%，α=0.05，功效=0.8），结果为每组10只幼虫。为了评估比较毒力，测试了非适应（NA）和适应分离株（P1、P5、P10；SP、RP、IP和HW），以及PBS和甲醇作为对照组。大蜡螟幼虫（每组10只，三个独立重复；总共270只幼虫）接种20 μL含有2 × 10⁶ 细胞的酵母悬浮液。每种处理通过幼虫左腹足的血腔注射进行。接种后，幼虫在37°C培养皿中孵育。在7天的时间内以24小时间隔监测存活率。通过无菌移液器头触觉刺激无运动来确定幼虫死亡。还用五种接种浓度（2 × 10⁶ 至 2 × 10² cells/20 μL）接种幼虫以确定半数致死剂量（LD₅₀）。此外，为了量化真菌负荷，我们在感染后0小时和48小时从幼虫提取血淋巴。将每只幼虫在冰上冷却10分钟。随后收集血淋巴并在1×PBS中系列稀释。通过在37°C孵育48小时后计数SDA上的CFU来量化每只幼虫的真菌负荷。

Preparation of histopathological sections from G. mellonella larvae

对于组织病理学程序，将每组半赤假丝酵母感染的大蜡螟幼虫保存在10%（v/v）PBS-福尔马林缓冲液中。使用无菌剃须刀将保存的幼虫分成三个横切段，通过梯度乙醇系列脱水，在二甲苯中透明，并在60°C真空下使用Leica TP1020半封闭台式组织处理器包埋在石蜡中。使用Thermo Scientific Microm HM 325切片机将组织块切成3–5 μm厚的连续切片，具体取决于样品质量。然后使用Thermo Scientific Gemini AS自动化设备用标准苏木精和伊红（H&E）对切片进行染色。最后，使用Olympus BX43显微镜观察染色的载玻片。

Statistical analysis

数据使用一系列检验进行统计分析，包括双尾未配对Student t检验、普通单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Tukey多重比较检验、双因素方差分析（two-way ANOVA）采用Sidak多重比较检验、卡方检验和生存分析（log-rank）检验，具体取决于实验背景。所有统计分析采用p < 0.05、p < 0.001和p < 0.0001的显著性阈值。使用GraphPad Prism 9.0软件和IBM SPSS Statistics进行数据分析。

Results

Intracellular survival and competitive growth of amoeba-adapted isolates

我们研究了CHC环境分离株对自由生活阿米巴棘阿米巴的共适应。我们检查了五个CHC分离株，详细见补充表S2：两个半赤假丝酵母（C. haemulonii）分离株（MH来自蘑菇，WH来自温泉水）和三个杜氏半赤假丝酵母（C. duobushaemulonii）分离株（BG来自甲虫肠道，ES1和ES2来自河口海水）。实验方法涉及共培养这些生物。为了分析酵母特性，我们在三个时间点从共培养（适应）和对照（非适应）样品中分离单个菌落：第3天（第1次传代）、第15天（第5次传代）和第30天（第10次传代）。五个菌株的适应和非适应分离株都在YPD琼脂平板上培养。在48小时内，在琼脂表面观察到由形态相似酵母细胞组成的独特菌落。

为了评估细胞内存活的差异，我们比较了适应分离株与其非适应分离株在被阿米巴吞噬后的存活百分比。结果发现，适应分离株WH、ES1和ES2在实验过程中其细胞内存活能力变化最小。相比之下，BG和MH的30天适应分离株显示出比其非适应菌株显著更高的存活百分比。此外，在阿米巴内观察到许多BG酵母细胞，导致宿主细胞裂解。这些发现表明，适应的酵母细胞可能被更频繁地吞噬或能够在阿米巴宿主内增殖。为了测试适应分离株增强的生长潜力，我们在72小时内监测了所有分离株的生长动力学。发现显示，BG和MH的适应分离株与其各自的对照组相比表现出加速的生长速率。此外，我们发现一些适应分离株具有独特的特征，显示细胞聚集。这种聚集表型在BG和MH的适应分离株中显现，特别是在BG的第10次传代中。然而，这一特征在其非适应分离株中不太明显，并且在来自不同菌株的其他适应分离株中不存在。这些结果表明，并非所有适应的CHC分离株对阿米巴存在都做出均匀反应。这些发现表明，长期暴露于阿米巴可能差异性地影响某些CHC菌株