综述：蚊幼虫微生物防治的当前进展与应用

本综述系统探讨了土壤阿米巴（Acanthamoeba castellanii）作为环境选择压力，诱导念珠菌（Candida haemulonii complex, CHC）特别是杜氏双溶血念珠菌（C. duobushaemulonii）发生表型转换（如光滑-粉红/粗糙-粉红/密集-粉红/菌丝-白色）、生物膜（biofilm）形成增强（生物量>15倍，胞外基质>2.2倍）及毒力基因（WOR1/CPH1/HGC1/ALS1/BCR1/EGF1）上调等适应性进化，显著提升其对环境胁迫耐受性及在Galleria mellonella模型中致病性（LD50降低71.5–97.1%），为理解环境微生物互作驱动真菌病原性进化提供了重要模型。

　　

阿米巴捕食诱导环境真菌毒力进化的机制研究

摘要

土壤阿米巴（Acanthamoeba castellanii）作为环境中的微型捕食者，其与微生物的相互作用被认为是驱动病原体毒力进化的重要选择压力。本研究以环境来源的念珠菌复合体（Candida haemulonii complex, CHC）为对象，重点探讨了杜氏双溶血念珠菌（C. duobushaemulonii）在与阿米巴长期共适应过程中发生的表型、基因表达及致病性变化。研究发现，阿米巴的捕食压力诱导酵母菌产生显著的形态可塑性，包括光滑-粉红（SP）、粗糙-粉红（RP）、密集-粉红（IP）和菌丝-白色（HW）四种稳定表型。这些适应性变异体表现出增强的细胞聚集能力、丝状化程度、生物膜形成能力（生物量提升超过15倍，胞外基质增加超过2.2倍）以及多种水解酶（如酯酶、磷脂酶、分泌型天冬氨酸蛋白酶）的分泌增加。在分子水平上，与形态双态性调控相关的基因WOR1（上调>2.4倍）、CPH1（上调4.8倍）、HGC1（上调>1.9倍）以及生物膜相关基因ALS1（上调>3.6倍）、BCR1（上调>14.5倍）、EGF1（上调>1.6倍）均显著上调。此外，适应性菌株对环境胁迫（高盐、高铁、极端pH）的耐受性增强。利用大蜡螟（Galleria mellonella）幼虫模型进行的致病性评估证实，阿米巴适应性菌株的毒力显著增强，其半数致死剂量（LD₅₀）较非适应性对照降低了71.5%至97.1%。这些结果表明，环境中的阿米巴-真菌相互作用是推动念珠菌毒力相关表型出现的关键生态驱动因素，为理解环境压力如何促进真菌病原性的进化提供了有价值的模型。

引言

真菌毒力的微进化是病原生物学研究的关键领域，为了解致病机制及其对人类健康的潜在影响提供了重要视角。机会性病原真菌的毒力特征往往并非在人类宿主体内进化而来，而是源于应对环境挑战的适应性反应，其中与微生物捕食者（如阿米巴）的相互作用尤为重要。阿米巴作为广泛存在于各种生态环境中的原生动物，其捕食行为对细菌和真菌施加了强大的选择压力，可能驱动了病原体毒力特征的进化。

念珠菌属（Candida）是免疫缺陷患者侵袭性感染中最常见的真菌病原体。尽管白色念珠菌（C. albicans）最为常见，但非白色念珠菌（Non-albicans Candida, NAC）物种，包括热带念珠菌（C. tropicalis）、克柔念珠菌（C. krusei）、近平滑念珠菌（C. parapsilosis）、光滑念珠菌（C. glabrata）、耳念珠菌（C. auris）、葡萄牙念珠菌（C. lusitaniae）以及溶血念珠菌复合体（C. haemulonii complex, CHC）的临床分离率正日益升高。CHC物种表现出强大的环境适应能力，并且经常对多种抗真菌药物（如两性霉素B、唑类、棘白菌素）产生体外耐药性，其暴发流行已引起广泛关注。

CHC物种的毒力因子包括水解酶的产生、表面粘附能力以及在医院环境中的持久存活能力，突出了其水平传播的潜力。其生态适应性，特别是与环境生物（如阿米巴）的相互作用，可能显著影响其毒力及致病因子的进化。本研究旨在探讨腐生性CHC物种与自由生活阿米巴的相互作用是否会潜在地增加真菌毒力，并利用大蜡螟幼虫感染模型验证其致病性变化。

材料与方法

本研究使用阿米巴（A. castellanii 30234株）与五种环境来源的CHC分离株（包括来自蘑菇的C. haemulonii MH、来自温泉水的C. haemulonii WH、来自甲虫肠道的C. duobushaemulonii BG以及来自河口的C. duobushaemulonii ES1和ES2）进行共培养实验。实验设置共适应组（酵母与阿米巴共培养）和对照组（酵母单独培养），每3天通过裂解阿米巴回收酵母细胞并传代至新鲜阿米巴培养物中，持续30天（10个传代周期）。在第3天（P1）、第15天（P5）和第30天（P10）分别收集酵母样本进行分析。

通过菌落形态观察、细胞聚集动力学测定、生物膜生物量及代谢活性检测、细胞外基质定量、环境胁迫耐受性试验（盐胁迫、铁胁迫、pH胁迫、热胁迫）、胞外水解酶（酯酶、天冬氨酸蛋白酶、溶血素、磷脂酶）活性测定以及实时定量PCR（qRT-PCR）分析毒力相关基因表达，全面评估适应性菌株的表型及分子特征。最后，利用大蜡螟幼虫模型进行体内致病性评估，包括生存率分析、半数致死剂量（LD₅₀）计算、真菌负荷定量以及组织病理学检查。

结果

阿米巴适应性菌株的细胞内存活与竞争性生长

与阿米巴共培养后，不同CHC分离株表现出差异化的适应性。其中，来自甲虫肠道的C. duobushaemulonii BG分离株和来自蘑菇的C. haemulonii MH分离株在30天适应后，其细胞内存活率显著高于非适应性菌株。BG分离株甚至能够导致阿米巴宿主细胞裂解。生长动力学分析显示，适应性BG和MH菌株的生长速率加快。此外，BG菌株在10代适应后表现出独特的细胞聚集表型，这可能是其抵抗阿米巴捕食的一种保护策略。

阿米巴适应性菌株的表型选择

在含有染料phloxine B的YPD平板上，适应性BG菌株在10代时呈现出四种稳定的形态变异体：光滑-粉红（SP）、粗糙-粉红（RP）、密集-粉红（IP）和菌丝-白色（HW）。显微镜观察显示，SP菌落包含正常酵母细胞和细胞聚集体；IP菌落由出芽酵母、细胞簇和一些伸长细胞组成；HW菌落同时存在酵母细胞和丝状形态；而RP菌落则以聚集的丝状形态为主。这些表型之间在温度变化（28°C与37°C转换）时表现出可逆的转换频率，证明了其显著的表型可塑性。

阿米巴对念珠菌生物膜形成的影响

与阿米巴的相互作用显著增强了C. duobushaemulonii BG菌株的生物膜形成能力。适应性P10菌株（SP, RP, IP, HW）的生物膜生物量、代谢活性和胞外基质产量均显著高于非适应性菌株。特别是IP和HW菌株形成了相互连接的酵母细胞网络，并产生大量胞外基质，表明其粘附性和群体生存能力得到强化。

阿米巴相互作用诱导形态变化和生物膜形成相关基因表达

基因表达分析显示，与形态双态性调控相关的转录因子基因WOR1、CPH1和细胞周期蛋白基因HGC1在适应性P10:RP和P10:HW菌株中显著上调。同时，与粘附相关的ALS1基因和生物膜形成调控基因BCR1、EGF1也在大多数适应性菌株中上调。这表明阿米巴相互作用通过调控这些关键基因，驱动了酵母的形态转换和生物膜发育。

阿米巴对适应性菌株环境胁迫耐受性的影响

胁迫耐受性实验表明，适应性显著改变了BG菌株对多种环境压力的反应。P10:SP、P10:RP和P10:IP菌株对高盐（0.5 M和1 M NaCl）的耐受性降低，而P10:HW菌株则表现出增强的耐盐性。所有P10菌株对高浓度铁（ Ferric Ammonium Citrate, FAC）的耐受性均增强。此外，P10:RP和P10:HW菌株能够在极端酸性（pH 3.0）和碱性（pH 10.0）条件下生长，但没有菌株能够耐受42°C的高温胁迫。这些结果揭示了阿米巴诱导的适应性赋予了真菌应对复杂环境挑战的能力。

阿米巴相互作用影响杜氏双溶血念珠菌BG菌株胞外水解酶的产生

酶活性测定显示，长期阿米巴适应显著提升了BG菌株的胞外水解酶产量。P10:HW菌株的酯酶活性最高，P10:IP、P10:RP和P10:SP菌株次之。分泌型天冬氨酸蛋白酶（SAP）活性仅在P10:HW菌株中检测到显著增加。所有菌株均具有溶血活性，但P1、P10:SP和P10:HW菌株的产量低于非适应性菌株。磷脂酶生产在P10菌株中被诱导，其中P10:HW菌株的产量最高。这些水解酶的增强有助于真菌对宿主组织的侵袭和损伤。

阿米巴适应性杜氏双溶血念珠菌BG菌株在大蜡螟幼虫中表现出增强的致病性

大蜡螟幼虫感染实验证实，阿米巴适应性菌株的毒力显著增强。接种P10:HW和P10:RP菌株的幼虫在最高感染剂量下分别于4天和5天内全部死亡，而非适应性菌株即使在最高剂量下也未引起完全死亡。LD₅₀分析表明，P10:HW菌株的毒力最强（LD₅₀ = 7.17 ± 2.14 × 10⁴ CFU/mL），其次是P10:RP菌株（LD₅₀ = 1.25 ± 0.15 × 10⁵ CFU/mL），而非适应性菌株的LD₅₀为2.52 ± 0.22 × 10⁶ CFU/mL。真菌负荷定量显示，P10各菌株在幼虫血淋巴中的CFU数量显著高于非适应性菌株。组织病理学检查发现，感染非适应性菌株的幼虫体内形成局限性的黑色素化结节和肉芽肿样结构，表明其免疫系统能有效控制感染。相反，感染适应性P10菌株的幼虫则出现广泛的黑色素化结节、组织损伤和大量真菌菌丝浸润，肉芽肿样结构罕见，反映了其免疫逃逸能力和更强的组织侵袭力。

讨论

本研究揭示了阿米巴作为环境选择压力，在驱动腐生性念珠菌复合体物种毒力进化中的关键作用。长期暴露于阿米巴捕食压力下，C. duobushaemulonii BG菌株进化出多种稳定的形态表型，并伴随毒力相关性状的全面增强。这种适应性进化涉及复杂的分子调控网络，包括双态性调控基因（WOR1, CPH1, HGC1）和生物膜相关基因（ALS1, BCR1, EGF1）的上调，最终表现为生物膜形成能力、环境胁迫耐受性、水解酶分泌以及体内致病性的显著提升。

真菌的形态可塑性，特别是酵母-菌丝转换和表型转换，是其应对环境压力和抵抗原生动物捕食的核心策略。本研究观察到的聚集性和丝状化表型，与念珠菌抵抗吞噬细胞（包括阿米巴和哺乳动物巨噬细胞）识别的能力密切相关。生物膜的增强不仅提供了物理屏障，还通过胞外基质对抗微生物药物和宿主免疫因子，进一步巩固了其生存优势。

适应性菌株对高铁和极端pH的耐受性增强，暗示其可能激活了保守的应激响应通路，如高渗透压甘油（HOG）通路、钙调磷酸酶（calcineurin）通路和Rim101/pH响应通路，以维持细胞内稳态。然而，其具体的分子机制仍需进一步阐明。

最重要的是，阿米巴诱导的适应性显著提升了真菌在感染模型中的毒力。LD₅₀的大幅降低和幼虫体内真菌负荷的急剧增加，强有力地证明了环境微生物互作可以直接塑造临床相关病原体的致病潜力。这一发现具有重要的“One Health”（一体健康）意义，提示环境生态系统中的相互作用是病原体新发威胁的潜在来源。

结论

本研究证实了环境阿米巴（A. castellanii）的捕食压力可诱导杜氏双溶血念珠菌（C. duobushaemulonii）发生深刻的适应性进化，包括表型转换、毒力因子增强和致病性提升。这一过程由关键毒力调控基因的上调所介导。研究结果强调了环境微生物相互作用在驱动人类病原真菌进化中的重要性，为了解机会性病原菌的生态起源及其毒力进化机制提供了新的视角，对未来新发真菌感染的预防和控制策略制定具有启示意义。