基于FRET底物对的碳酸酯/羧酸酯酶促水解动力学研究及脂肪酶活性筛选

本研究针对碳酸酯酶活性筛选需求，开发了新型同源FRET底物对，通过化学酶法合成实现了羧酸酯与碳酸酯水解活性的同步检测。研究人员发现CALB和HIC对碳酸酯具有显著水解活性（HIC的kcat/KM达476 M?1s?1），为可生物降解碳酸酯材料的温和合成提供了新筛选平台。

　　

通过比较羧酸酯与碳酸酯的酶促水解特性，研究人员设计了一对基于荧光共振能量转移（FRET）的同源底物。这些含有C6脂肪链的碳酸酯和羧酸酯末端胺基与异硫氰酸荧光素（FITC）偶联，完整状态下会发生部分自淬灭，而在水解反应时荧光强度增强。采用三步化学酶法合成策略制备该底物对后，对来自南极假丝酵母（Candida antarctica）的脂肪酶A（CALA）、脂肪酶B（CALB），瘤胃热真菌（Thermomyces lanuginosus）脂肪酶（TLL）以及疏棉状嗜热丝孢菌（Humicola insolens）角质酶（HIC）进行了动力学表征。结果显示CALA和TLL对两种底物几乎无活性，而CALB和HIC能有效水解两者，其中对羧酸酯底物的偏好性更强（特异性参数k_cat/K_M高出3-8倍）。值得注意的是，虽然CALB常用于碳酸酯的醇解反应，但HIC对碳酸酯底物的水解效率更高（k_cat/K_M值分别为476 M^?1s^?1和162 M^?1s^?1）。通过核磁共振（NMR）监测碳酸二乙酯（DEC）水解的实验进一步验证了该酶活性排序。该底物对与检测方案为大规模筛选碳酸酯活性酶提供了新工具，有望推动具有可调控特性的可生物降解碳酸酯材料的温和水解或合成应用。