炎症相关蛋白通过孟德尔随机化揭示卵巢功能不全的因果作用与治疗靶点

《Journal of Inflammation Research》：Maresin 1 Alleviates Seizure Symptoms by Modulating the Crosstalk Between Inflammation and Ferroptosis

本综述采用孟德尔随机化（MR）方法，首次系统评估了91种炎症相关蛋白与早发性卵巢功能不全（POI）的因果关联。研究鉴定出CXCL10、CX3CL1等保护性因子及IL-18R1、MCP-1/CCL2等风险因子，并通过实验验证关键靶点。结合基因-药物分析，提出染料木黄酮（genistein）和褪黑素（melatonin）等潜在治疗策略，为POI的病因学研究和靶向治疗开辟了新视角。

　　

Abstract

Purpose

原发性卵巢功能不全（POI）表现为卵巢功能障碍，由卵巢储备功能减退（DOR）发展而来。然而，其发病机制尚不清楚。本研究旨在从遗传水平分析炎症相关蛋白与POI发生之间的因果关系，并从炎症相关基因中识别潜在的可成药基因靶点。

Patients and Methods

研究人员进行了孟德尔随机化（MR）分析，以探索炎症相关蛋白与POI的因果关联。91种炎症相关蛋白的遗传工具变量来源于包含14,824名欧洲参与者的Olink^? Target Inflammation panel。POI的汇总统计数据（424例病例和118,796例对照）来自FinnGen联盟。此外，通过结合DOR患者的Olink结果与MR结果，研究人员重点研究了卵巢衰老中五个关键的炎症相关分子。所有结果均在POI模型中通过Western-blot和RT-PCR进行了验证。通过生物信息学分析揭示了潜在通路，并通过DGIdb数据库进行了潜在药物筛选。

Results

通过逆方差加权（IVW）方法，研究发现两种蛋白CXCL10和CX3CL1可能对POI发挥保护作用；而IL-18R1、IL-18、MCP-1和CCL28可能会增加POI的风险。此外，Wald比值分析强调了其他保护性蛋白，如IL-17C、TRANCE、uPA、LAP TGF-β1和CXCL9；以及风险蛋白，包括TNFSF14、CD40、IL-24、ARTN、LIF-R和IL-2RB。同时，MCP-1/CCL2、TGFB1、ARTN和LIFR在POI模型中表达显著改变，这些分子汇聚于Oncostatin M信号通路。值得注意的是，基因-药物分析将CCL2和TGFB1确定为潜在的治疗靶点，而染料木黄酮（genistein）和褪黑素（melatonin）被优先列为POI治疗的潜在药物。

Conclusion

该研究揭示了特定炎症相关蛋白在POI中的因果作用，增进了对其病因学的理解，并进一步扩展了改善卵巢功能和延缓POI发病的治疗选择。

Introduction

原发性卵巢功能不全（POI）是器官特异性衰老的一个独特例子，表现为40岁之前发生的原发性或继发性闭经。POI患者表现出卵巢功能障碍特征，如卵泡数量减少，这源于卵巢储备功能减退（DOR）。月经不调、生育能力下降、潮热、盗汗以及骨质疏松症等，严重威胁POI女性的生理和心理健康。然而，尽管POI的临床表现已得到广泛认识，但其潜在机制仍不清楚。此外，POI的临床治疗手段有限。现有的主要治疗方法，包括激素替代疗法（HRT，雌激素和孕激素补充）、生育干预计划（使用捐赠卵子的辅助生殖技术和卵巢组织冷冻）以及支持性护理（钙和维生素D补充、生活方式调整和心理辅导），并未给POI患者带来良好的预后。

近年来，研究表明炎症反应在包括POI在内的多种卵巢疾病的发展中起着关键作用。炎症因子可能通过调节免疫系统和细胞信号通路来影响卵巢功能，从而影响女性生殖健康。Huang等人进一步提出，由核因子κB（NF-κB）调节的细胞因子，包括IL-1β、IL-2和IL-6，在POI的发病机制中起着重要作用。因此，研究炎症相关因子在POI中的作用对于理解其发病机制具有重要意义，并可能为临床治疗提供潜在的靶点。

传统的观察性研究虽然有助于揭示炎症因子与POI之间的关联，但无法建立因果关系。为了进一步阐明炎症因子与POI之间的因果联系，孟德尔随机化（MR）提供了一个强大的工具。MR利用与暴露（如炎症因子）相关的遗传变异作为工具变量（IVs），可以在最小化混杂偏倚的同时进行因果推断，使其成为研究遗传变异与疾病关联的优秀工具。在此基础上，在遗传水平上寻找药物靶点将为POI新药靶点的开发和女性生育力的保护提供巨大帮助。

本研究旨在利用MR方法探索炎症相关因子与POI之间的因果关系，并通过基因-药物分析识别潜在的治疗靶点。通过分析大规模全基因组关联研究（GWAS）的数据，研究人员从91种炎症蛋白中推导出遗传变异，并评估了它们对POI的潜在影响。此外，通过结合DOR患者的Olink蛋白质组学结果和在POI模型中的遗传验证，研究人员试图揭示卵巢功能障碍和卵巢衰老中炎症状态改变的关键基因/蛋白。最后，通过基因-药物分析和生物信息学分析，获得了优先考虑的可成药基因靶点、潜在机制和通路，为新的治疗策略提供了基础。本研究旨在为POI的生物学基础提供新的见解，并为识别潜在治疗靶点提供依据。

Materials and Methods

Study Design

研究的整体结构如图所示。对于非干预性研究，根据国家法律（中国2023年2月18日发布的《涉及人的生命科学和医学研究伦理审查办法》第三十二条第一项和第二项），不需要伦理批准。

MR研究的基本原理是利用与暴露和结局相关的遗传变异作为IVs来确定两者之间是否存在因果关系。研究提出了三个不可或缺的MR假设：（1）遗传工具与暴露相关；（2）遗传变异独立于任何混杂因素；（3）遗传工具仅通过风险变量影响结局。

Data Source for Inflammation-Related Proteins

91种炎症相关蛋白的最新GWAS数据来自11个队列的14,824名欧洲参与者。通过使用Olink^? Target Inflammation panel测量全基因组遗传数据和血浆蛋白质组学数据，Zhao等人生成了炎症相关蛋白的数据。对每个队列应用基于线性回归的加性遗传关联模型进行GWAS分析。详细的质控信息可在原始文献中获取。

Data Source for POI

FinnGen联盟（FinnGen）提供了424例芬兰成年女性POI病例和118,796例对照的GWAS汇总统计数据。POI的诊断依据国际疾病分类第10版（ICD-10）确定，该分类将“原发性卵巢衰竭”归入“卵巢功能障碍”（E28）的亚类E28.3。

Selection of Instrumental Variables

为了满足MR假设，研究人员识别了与炎症相关蛋白相关且在P值<5×10^?8阈值下具有全基因组显著性的SNPs。还应用了基于连锁不平衡（LD）的聚类（窗口大小10,000 kb，R²<0.001）以确保IV的独立性。所有IVs均使用F统计量进行估计以避免工具变量偏倚，F统计量<10的SNPs被排除。

Statistical Analysis

通过两样本MR分析探索炎症相关蛋白与POI之间的因果关系。IVW方法作为主要方法，提供了所有遗传变异因果效应的一致估计。还采用了Wald比值、加权中位数（WM）、MR-Egger、简单模式和加权模式方法来估计炎症相关蛋白与POI之间的因果效应。

为了评估遗传变量之间的独立效应是否会违反MR分析的假设，还进行了敏感性分析。采用Cochran’s Q检验量化异质性，P>0.05代表无异质性，P<0.05表明存在基因间异质性的可能性。水平多效性检测采用MR-Egger方法（通常以MR-Egger的截距表示）和MR-PRESSO全局检验。MR-Egger检验的截距代表效应估计中的潜在偏倚，P值<0.05表明IVs存在水平多效性。“留一法”（LOO）分析理想的结果应是依次剔除每个SNP不会显著改变结果，证明MR分析的可靠性和稳健性。

具体实施过程如下：MR程序和敏感性分析使用R软件中的“TwoSampleMR”软件包实现。使用Bonferroni校正计算多重检验的显著性阈值。P值小于1e-04的炎症相关蛋白被定义为显著。对于POI并发症，调整后的P值显著性阈值为1e-03。在敏感性分析检验中，双侧P值<0.05被认为具有统计学意义。

Comprehensive Analysis and Experimental Validation

DOR患者的Olink蛋白质组学结果来源于研究人员之前的发现，蛋白质组学结果与本次MR结果通过Wekemo Bioincloud进行交叉分析。

人颗粒细胞样肿瘤细胞系（KGNs）在RPMI 1640培养基中培养，并在37°C、5% CO₂条件下培养。KGNs细胞用1 mg/mL环磷酰胺（CTX）处理48小时以建立POI模型。

Western-blot分析用于测量蛋白水平。部分一抗购自Proteintech Technology，包括抗单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）抗体、抗白血病抑制因子受体（LIF-R）抗体和抗GAPDH抗体。抗转化生长因子β-1（TGF-β1）抗体、抗肿瘤坏死因子配体超家族成员14（TNFSF14）抗体和抗Artemin（ARTN）抗体购自Bioss Technology。也使用了二抗。

使用TRIzol法提取总RNA，并使用Nanodrop 2000定量。使用SeqHunt^? First Strand cDNA Synthesis Kit和2x Blue universal SYBR qPCR master mix测量每个基因的mRNA水平。表1列出了本研究中使用的引物序列。

Bioinformatics Analysis

通过STRING软件分析蛋白质-蛋白质相互作用网络。基因注释后，使用基因本体论（GO）数据库分析细胞组分、分子功能和生物过程。使用KEGG数据库进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析（错误发现率<5.00%），同时还进行了WikiPathways富集分析。

Potential Drug Screening

药物-基因相互作用数据库（DGIdb）是一个公共资源，汇集了基因或基因产物、药物和药物-基因相互作用记录，广泛用于药物靶点探索。研究人员使用DGIdb数据库搜索对POI显著的4个已验证潜在基因的潜在药物。通过将潜在药物的可成药基因与使用药物的靶点进行匹配，确定了优先考虑的潜在药物。使用SankeyMATIC软件创建桑基图以可视化药物与可成药靶点之间的关联（前20个可成药靶点）。

Results

Causality of Inflammation-Related Proteins on POI

本研究共纳入了与91种炎症蛋白对应的99个SNPs。通过IVW方法的乘性随机效应模型，研究人员确定了6种与POI存在潜在因果关联的炎症蛋白（表2），并通过Wald比值法确定了另外11种炎症蛋白（表3）。具体而言，使用IVW方法发现两种炎症蛋白与POI存在负向因果关系，例如C-X-C基序趋化因子10（CXCL10）和Fractalkine（CX3CL1），表明CXCL10和CX3CL1可能对POI具有保护作用。此外，四种炎症蛋白与POI风险增加相关，包括白细胞介素18受体1（IL-18R1）、白细胞介素18（IL-18）、MCP-1和C-C基序趋化因子28（CCL28）。Wald比值法用于单SNP暴露分析。确定了五种与POI风险降低相关的炎症蛋白，包括白细胞介素17C（IL-17C）、TNF相关激活诱导细胞因子（TRANCE）、尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）、潜伏相关肽转化生长因子β-1（LAP TGF-β1）和C-X-C基序趋化因子9（CXCL9）。相反，发现另外六种炎症蛋白与POI风险升高相关，包括TNFSF14、CD40L受体（CD40）、白细胞介素24（IL-24）、ARTN、LIF-R和白细胞介素2受体亚基β（IL-2RB）。

Sensitivity Analysis

通过敏感性分析进一步评估了IVW结果的稳健性。对于通过IVW挖掘的6种炎症相关蛋白，MR-Egger截距检验未发现水平多效性的明确证据（P>0.05；表4）。Cochran’s Q检验也显示IVs之间无异质性（P>0.05；表4），表明估计结果是稳健的。对于CXCL10、MCP-1和IL-18R1，5种MR方法的SNP效应方向一致（图2A–C），而对于IL-18和CCL28，MR Egger方法的SNP效应方向不同（图2D和E）。由于研究中只有一个CX3CL1 SNP，仅使用IVW方法进行敏感性分析（图2F）。由于MR方法结果不显著（表2），研究人员通过IVW方法探讨了SNP效应。还进行了LOO分析以评估单个SNP对炎症调节因子与POI风险关联的影响（图3）。通过排除任何一个SNP，CXCL10、IL-18R1、IL-18、MCP-1、CCL28与POI之间的因果关系不太可能受某些SNP的影响。

Comprehensive Analysis and Experimental Validation

Gleicher等人提出POI和DOR代表了不同病因的过早卵巢衰老的表型连续谱。为了更好地理解炎症相关蛋白/基因在卵巢衰老中的持续作用，研究人员随后通过维恩网络比较了DOR患者卵泡液中差异表达的蛋白质（使用Olink结果）和通过MR结果确定的POI因果相关蛋白（图4A）。MCP-1、LAP TGF-β1、TNFSF14、ARTN和LIF-R是交集蛋白，可能是卵巢衰老过程中炎症状态改变的关键蛋白。MCP-1和ARTN在POI模型中显著增加，而TGF-β1和LIF-R在POI中显著降低。此外，TNFSF14水平表达无显著差异（图4B）。

为了进一步探索潜在的可成药基因靶点，研究人员测量了POI模型中五个基因（CCL2、TGFB1、TNFSF14、ARTN、LIFR）的差异表达。与蛋白水平相对应，TNFSF14基因在POI模型中也未见显著差异表达（图4C）。CCL2和ARTN的mRNA水平在POI中显著增加（图4D和E），而TGFB1和LIFR在POI中显著降低（图4F和G）。

Bioinformatics Analysis

保护性蛋白（图5A）和风险蛋白（图5B）之间存在蛋白质-蛋白质相互作用。GO分析显示，大多数保护性基因参与细胞表面受体信号通路（7个基因）和应激反应（7个基因），而风险基因参与对化学物质的反应（10个基因）、信号转导（10个基因）和生物过程的正向调控（10个基因）（图5C）。NF-κB信号通路在保护性基因和风险基因中均有富集；然而，IL-17信号通路（两个基因；IL17C, CXCL10）在保护性基因中富集，而JAK-STAT信号通路（三个基因；IL2RB, IL24, LIFR）在风险基因中富集（图5D）。WikiPathways分析强调了IL-18信号通路（三个基因；CCL2, IL18, IL18R1）和Oncostatin M信号通路（两个基因；CCL2, LIFR）在POI风险基因中的作用（图5E）。由于CCL2和LIFR已在遗传水平得到验证，研究人员更加确定Oncostatin M信号通路在卵巢衰老中的作用。

Potential Drug Screening

研究人员通过DGIdb搜索了对POI显著的4个已验证潜在基因（CCL2, TGFB1, ARTN, LIFR），共获得66种潜在药物，其中ARTN基因没有任何潜在药物。可成药靶点与药物的桑基图突出了优先考虑的潜在药物和靶点（图6），重点关注CCL2和TGFB1等潜在基因。针对LIFR的潜在药物Emilermin仅作用于LIFR基因，与当前使用的POI药物靶点不同。针对CCL2的潜在药物靶向CYP酶家族基因，可能通过抑制铁死亡来治疗POI。针对TGFB1的潜在药物可以靶向几个已知的POI药物靶点（BDNF, VDR, ESR1, ESR2等）以及MR结果中的POI保护性基因（PLAU），使其成为优先考虑的治疗靶点。

Discussion

该研究使用双向MR框架探索了炎症相关蛋白与POI之间的因果关联。这些发现揭示了特定的炎症蛋白可能对POI风险具有保护性或有害影响。这些结果为POI的病理生理学提供了新的见解，并为治疗干预提供了潜在靶点。

研究通过IVW方法确定了六种与POI存在显著因果关联的炎症蛋白，包括显示出保护作用的CXCL10和CX3CL1，以及与POI风险增加相关的IL-18R1、IL-18、MCP-1和CCL28。此外，Wald比值分析强调了其他保护性蛋白，如IL-17C、TRANCE、uPA、LAP TGF-β1和CXCL9，以及风险蛋白，包括TNFSF14、CD40、IL-24、ARTN、LIF-R和IL-2RB。

CXCL10和CX3CL1显示出对POI的强保护作用。两者都以调节免疫反应而闻名，特别是在募集和激活免疫细胞方面。Wang等人证明，CXCL10的浓度（在血清和卵泡液中）与卵巢储备功能呈负相关。CXCL10可能通过促进胶原蛋白合成和引起卵巢纤维化发挥作用。CX3CL1是唯一的CX3C趋化因子，可通过激活特异性受体CX3CR1形成CX3CL1/CX3CR1轴来驱动多种疾病。Raei等人发现，CX3CL1表达不足与颗粒细胞凋亡增加和炎症有关。此外，在晚期卵巢癌患者的血清中也发现了显著升高的CX3CL1水平。另外，通过Wald比值法鉴定的蛋白质，如IL-17C、TRANCE和uPA，参与促进组织修复和调节炎症反应，这可能有助于卵巢修复功能。同时，排卵前卵泡的卵巢表面上皮细胞可分泌uPA参与卵巢排卵。这些蛋白可能通过抑制炎症信号通路，如NF-κB信号通路（TRANCE, uPA）和IL-17信号通路（IL-17C, CXCL10）来发挥保护作用。

除了保护性蛋白，研究也识别了风险蛋白。与POI风险增加相关的炎症蛋白，如IL-18、IL-18R1和MCP-1，是众所周知的参与慢性炎症的促炎介质。例如，在CTX诱导的POI大鼠中，IL-18诱导颗粒细胞焦亡并损害卵巢储备。类似地，MCP-1（也称为趋化因子配体2 CCL2），一种有效的单核细胞趋化剂，可能通过肥胖小鼠的长期炎症导致卵母细胞质量受损。通过Wald比值法鉴定的IL-2RB、IL-24和LIF-R已被证明会驱动失调的炎症反应并加剧卵巢功能不全。WikiPathways分析强调了IL-18信号通路（IL-18, IL-18R1, MCP-1）和Oncostatin M信号通路（MCP-1, LIF-R），而KEGG分析中JAK-STAT信号通路（IL-2RB, IL-24, LIFR）富集。由于CCL2和LIFR已在遗传水平得到验证，研究人员更加确定Oncostatin M信号通路在卵巢衰老中的作用，这与之前的研究一致。

通过基因-药物分析，BDNF、VDR、ESR1和ESR2是当前使用的POI药物的已知靶点。通过交叉参考药物靶点和初步药理学筛选，研究人员更倾向于认为染料木黄酮（genistein）、维A酸（tretinoin）和异维A酸（isotretinoin）等药物是治疗POI的潜在药物。由于维A酸和异维A酸在孕妇中禁忌，研究人员推荐染料木黄酮作为POI患者的首选。有趣的是，NFE2L2/NRF2被认为是铁死亡的关键调节因子，CYP酶家族基因也可以驱动铁死亡。研究表明，可以使用染料木黄酮、维A酸和褪黑素药物通过靶向铁死亡来治疗POI。需要进一步的药理学实验来确认这些治疗策略的有效性和安全性。

研究结果强调了炎症在卵巢功能中的重要且双重作用，强调在卵巢衰老过程中维持平衡的免疫反应的必要性。POI潜在可成药基因的鉴定也为理解POI发病机制和建立新的药物疗法提供了新的见解。

本研究的一个主要优势在于稳健的MR设计，它最大限度地减少了混杂和反向因果偏倚，从而能够进行更可靠的因果推断。此外，敏感性分析（包括LOO和MR-Egger检验）验证了研究结果的稳健性。然而，有几个局限性需要注意。首先，研究聚焦于欧洲人群，因此限制了结果对其他种族群体的普适性。其次，FinnGen的POI统计数据来自相对较小的样本量，这可能降低了检测较弱关联的能力。第三，虽然MR减少了混杂因素带来的偏倚，但它无法解释所有潜在的偏倚来源，例如敏感性分析未捕捉到的多效性效应。最后，本研究中获得的POI治疗优先药物仍需在细胞系和动物模型中进行进一步研究，然后才能进行临床应用。

Conclusions

该研究揭示了特定炎症相关蛋白在POI中的因果作用，增进了对其病因学的理解。并且，通过实验验证和基因-药物筛选，进一步扩展了改善卵巢功能和延缓POI发病的治疗选择。

Author Contributions

所有作者对报告的工作做出了重大贡献，无论是在构思、研究设计、执行、数据获取、分析和解释方面，还是在所有这些方面；参与起草、修改或批判性审阅文章；同意最终要发表的版本；同意文章提交的期刊；并同意对工作的所有方面负责。

Disclosure

作者声明本研究是在没有任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

Data Sharing Statement

当前研究期间生成和分析的数据集可在FinnGen数据库和GWAS数据库中获取。支持本研究结果的数据可根据合理要求从通讯作者处获得。