Bibio hordeiphagus 有丝分裂基因组揭示双翅目Bibionomorpha下目系统发育关系

本研究首次报道了双翅目Bibionidae科Bibio hordeiphagus Yang & Luo的完整线粒体基因组（mitogenome），其长度为15,496 bp，包含13个蛋白质编码基因（PCGs）、22个tRNA基因、2个rRNA基因及一个控制区。研究通过测序与注释，支持了Bibionidae科与Bibio属的单系性，并基于线粒体基因组数据初步解析了Bibionomorpha下目的高级系统发育关系，为双翅目昆虫进化研究提供了新的分子证据。

　　

引言

Bibionomorpha下目是双翅目昆虫中一个物种丰富的类群，包含超过1,400个属，被划分为Sciaroidea、Bibionoidea、Anisopodoidea和Scatopsoidea四个总科。然而，这些类群之间的系统发育关系仍存在争议，特别是Anisopodidae科是否属于该下目的问题，形态学证据与分子数据给出了不同的答案。Bibionidae科是一个全球分布的昆虫类群，包含三个亚科和超过700个已报道物种。早期的研究支持该科为单系群，但基于核基因（18S、28S、CAD）和线粒体基因（12S、16S、COX1）的联合分析却显示其可能为并系群。Bibio Geoffroy, 1762是Bibionidae科中最大的属，在中国有超过55个物种，然而该属的线粒体基因组数据非常有限，目前NCBI数据库中仅有Bibio marci和Bibio rufiventris两条记录，且均缺乏详细的注释信息。本研究关注的物种Bibio hordeiphagus Yang and Luo于1988年首次在中国西藏札达报道，是青稞（Hordeum vulgare）的一种害虫。本研究旨在首次测定并注释B. hordeiphagus的完整线粒体基因组，并对已发表的B. rufiventris线粒体基因组进行注释，进而基于线粒体基因组数据探讨Bibionomorpha下目的系统发育关系。

材料与方法

标本

B. hordeiphagus标本由薛传振和郭鹏辉于2024年7月12日使用马氏网在青海海晏（100°57′36″N, 36°53′39″E, 海拔3060米）采集。所有标本保存于95%乙醇中，并存放于中国农业大学昆虫博物馆（CAU）的-20°C冰箱中。

DNA提取与测序

使用CTAB法从一只雄性B. hordeiphagus成虫中提取基因组DNA。通过琼脂糖凝胶电泳和微量分光光度计评估DNA的完整性和纯度，DNA浓度为3.44 ng/μL。合格的DNA样本送至天津的Tsingke Biotechnology Co., Ltd.进行测序。使用Covaris将10 ng基因组DNA随机打断，选取200-400 bp的片段，经过末端修复、加A尾、接头连接和PCR扩增后，使用AxyPrep Mag试剂盒纯化。使用Nextera XT DNA文库制备试剂盒构建插入片段为350 bp的DNA测序文库，随后在Illumina Novaseq 6000平台上进行双端测序。

组装与注释

使用fastp 0.24.0软件过滤原始数据，去除N碱基含量超过5%、低质量碱基数（质量值≤5）达到50%以及含有接头污染的 reads。过滤后获得4.46 GB的清洁数据，GC含量为28.25%，Q20值为98.01%，Q30值为94.09%。随后使用SPAdes v3.14.1软件对清洁数据进行de novo组装，k-mer值设置为21, 45, 65, 85, 105。使用MitoFinder v1.4.1对组装得到的完整线粒体基因组进行注释，并手动校正注释结果。最后使用Organellar Genome DRAW v1.2绘制线粒体基因组环状图。对NCBI上的另一个物种B. rufiventris的线粒体序列使用GeSeq进行注释。

系统发育分析

本研究选取了来自Bibionomorpha下目的14个线粒体基因组（包括13个已发表数据和1个新测序数据）来重建系统发育树。其中包含了Bibionidae科的6个线粒体基因组（代表4个属）。同时选取了Bibionomorpha下目其他总科的代表物种（Sciaroidea总科5个，Anisopodoidea总科2个，Scatopsoidea总科1个）以验证分析的稳定性。以两种Tipulidae科昆虫Tipula aestiva和Tipula varipennis作为外群。分析数据集包含全部13个PCGs和2个rRNAs。使用PhyloSuite v1.2.3内置的ModelFinder v2.2.0模块确定最优的分区方案和碱基替换模型。使用同样集成在PhyloSuite v1.2.3中的IQ-TREE软件，采用最大似然法（ML）重建系统发育树。使用iTOL v7对系统发育树进行可视化。

结果

B. hordeiphagus线粒体基因组特征

B. hordeiphagus的完整线粒体基因组（GenBank登录号：PQ863320）长度为15,496 bp，包含37个基因，即13个蛋白质编码基因（PCGs）、22个tRNA基因、2个rRNA基因和一个控制区。该线粒体基因组具有无脊椎动物线粒体基因组的典型特征，且与已发表的Bibio属其他物种数据一致。其整体核苷酸组成为腺嘌呤（A）40.55%，胸腺嘧啶（T）39.02%，鸟嘌呤（G）8.37%，胞嘧啶（C）12.05%，AT偏好性（AT-skew）为0.02，GC偏好性（GC-skew）为-0.18。在整个线粒体基因组中，存在16个基因间隔区和7个基因重叠区。最长的间隔区长56 bp，位于ATP6和COX3之间；最长的重叠区长7 bp，位于tRNA^Trp和tRNA^Cys之间。大多数PCGs以ATT或ATG作为起始密码子，但ND4L以ATA起始，COX2以TTG起始。大多数PCGs以TAA和TAG终止，但ND5以TAT终止。

系统发育分析

基于14个Bibionomorpha下目物种的线粒体基因组数据构建了系统发育树。结果显示，Bibio属以100%的自举支持率构成一个单系群，并且与Dilophus属构成姐妹群关系。而Plecia属和Penthetria属则共同作为Bibio属和Dilophus属的姐妹群。此外，系统发育分析结果强有力地支持了Bibionomorpha下目内所有科的单系性，包括支持率为100%的Bibionidae科。各科之间的系统发育关系为：（Scatopsidae科 + Anisopodidae科）+ ((Mycetophilidae科 + Sciaridae科) + Bibionidae科)。

讨论与结论

先前的研究已多次探讨Bibionomorpha下目的系统发育关系，但Anisopodidae科的系统发育位置仍未解决。Wiegmann等人的研究利用来自14个核基因和完整线粒体基因组的近30 kb序列数据构建了双翅目的系统发育关系，将Anisopodidae科置于Bibionomorpha下目所有其他科的姐妹群位置。?ev?ík等人的结果也暗示Anisopodidae科位于Bibionomorpha下目的早期分支上。Zhang等人的研究仅使用了完整的线粒体基因组，结果表明Anisopodidae科与短角下目（Brachycera）构成姐妹群，而Xiao等人的文章则提出Scatopsidae科，而非Anisopodidae科，是Bibionomorpha下目所有其他科的姐妹群。本研究构建的系统发育树支持了上述大多数研究提出的排列方式，但将Anisopodidae科置于Bibionomorpha下目的一个更早期分支上，使其与Scatopsidae科构成姐妹群。这一结果与Wiegmann的研究较为接近，并支持了Bibio属的单系性。Zhang等人研究中Anisopodidae科位置的改变可能归因于物种取样的差异，而非分子标记的选择。目前关于Bibionomorpha下目的数据仍然不足，未来的研究应联合使用核基因和线粒体序列进行分析，并包含短角下目的序列数据。此外，需要收集更多的分子数据来解决这一存在争议的问题。

数据可用性声明

支持本研究结果的基因组序列数据可在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）公开获取。GenBank登录号为PQ863320。BioSample、BioProject和SRA的登录号分别为SAMN47560672、PRJNA1241534和SRP572896。