SF3B1突变敏感型隐性3'剪接位点的前体RNA结构模式解析及其在血液疾病中的机制研究

本研究深入探讨了剪接体核心组分SF3B1基因K700E突变导致3'剪接位点识别异常的分子机制。通过化学探针（SHAPE-MAP）技术分析RNA二级结构，发现SF3B1敏感型隐性剪接位点（MT C3SS）具有独特的结构柔性、弱剪接位点强度及延长的多聚嘧啶序列特征，为骨髓增生异常综合征（MDS）等血液疾病的致病机制提供了新见解。

　　

ABSTRACT

SF3B1是剪接体（spliceosome）的核心组分，参与分支点识别和3'剪接位点选择。其K700E突变（赖氨酸至谷氨酸）常见于骨髓增生异常综合征（MDS）及其他血液疾病。该突变导致细胞利用新型隐性3'剪接位点（cryptic 3’ splice sites, C3SS），但其敏感性与耐药性的分子基础尚未明确。本研究通过RNA测序与化学结构探测，鉴定出192个SF3B1敏感型（MT C3SS）和2800个耐药型（WT C3SS）隐性剪接位点，发现MT C3SS嵌入延长的多聚嘧啶序列中，且其配对的标准剪接位点强度显著较弱。

Introduction

人类转录组中超过95%的基因含有内含子，需通过剪接移除以生成成熟RNA。选择性剪接（alternative splicing）可产生多种异构体，该过程受5'剪接位点、分支点、多聚嘧啶序列和3'剪接位点等核心信号调控。SF3B1与U2AF1等剪接体核心组分的突变广泛影响剪接过程，并与血液疾病和癌症相关。其中，SF3B1 K700E突变导致大量3'剪接位点异常使用，即隐性剪接。

RNA结构在转录过程中即时形成，可通过二级和三级结构调控RNA结合蛋白（RBP）及核糖核蛋白（RNP）复合物的结合。尽管RNA结构在pre-mRNA加工中的作用已被证实（例如MAPT基因中的发夹结构调控剪接），但其在SF3B1突变导致的隐性剪接中的具体角色仍不明确。

Results

SF3B1 K700E突变导致剪接位点亚群的一致性错误剪接

SF3B1 K700E突变引起全转录组范围内的剪接异常，特别是在3'剪接位点选择上表现为内含子滞留和隐性剪接位点使用增加。通过整合NALM-6、K562细胞系及MDS患者数据，研究鉴定出192个在多个数据集中一致发生剪接改变的隐性3'剪接位点（MT C3SS）。这些基因显著富集于核质运输通路（如IPO7、TNPO3、TPR）和组蛋白修饰过程。与ENCODE数据库中其他RBP敲低数据相比，SF3B1突变引起的3'剪接异常更为显著。

SF3B1敏感型剪接位点的序列特征

MT C3SS与WT C3SS在GC含量、剪接位点强度（MAXENT评分）及核苷酸组成上存在显著差异。MT C3SS的配对标准位点较弱，且其隐性位点嵌入延长的多聚嘧啶序列中，上下游尿苷（U）分布异常，而腺嘌呤（A）比例较高。这些序列特性表明MT C3SS缺乏明显的剪接信号区分度。

3'剪接位点模体的结构可及性模式保守

通过体外和体内（核内）SHAPE-MAP探测83个MT和39个WT剪接连接区，发现NAG剪接模体（N为任意核苷酸）具有保守的可及性模式：N位反应性低，A位反应性高，G位反应性中等。该模式在隐性和标准剪接位点中均存在，但MT C3SS的A位反应性显著低于WT，且其与周围序列的结构区分度较低。

计算模拟（RNAfold、scanFold）表明，MT连接区具有更高的整体柔性、更低的结构稳定性及更高的系综多样性，其碱基配对程度显著低于WT。

SF3B1敏感型剪接位点具有高结构柔性

MT剪接位点周边区域显示较低的Z值（结构稳定性低）和高系综多样性，表明其倾向于形成多种非稳定结构。体内外SHAPE数据高度相关（平均Spearman ρ=0.74），验证了该结论。最小自由能（MFE）结构分析进一步证实MT位点周边碱基配对较少。

Discussion

本研究揭示了3'剪接位点NAG模体的特征性可及模式，并提出其反应性幅度差异可能作为剪接位点识别的结构标志。MT C3SS表现出高柔性、低稳定性和弱序列信号，这些特性共同导致其在SF3B1突变背景下易被误选。结果提示，剪接连接区的识别依赖于前体mRNA大范围区域的结构与序列多特征协同作用。

Methods

研究使用NALM-6 SF3B1 K700E突变与野生型细胞进行RNA测序，并通过rMATS分析剪接事件。基因片段设计包含450 bp剪接位点侧翼序列，采用体外转录与SHAPE-MAP（5NIA探针）获取结构数据。体内结构探测通过核分离与特异性引物扩增实现。数据分析依托shapemapper2、ViennaRNA及scanFold完成。

Author contributions

Herbert与Lackey设计并指导实验，Herbert完成数据整理与形式分析，多位作者共同参与实验与文稿撰写。