百年橄榄树初榨橄榄油的营养与健康声称合规性研究：不饱和脂肪酸、生育酚及酚类化合物的分析

本研究发现，来自葡萄牙C?a Valley地区百年橄榄树的初榨橄榄油（VOO）在营养与健康声称方面表现出卓越潜力。所有样本均符合“高不饱和脂肪酸（UFA）来源”标准（≥70%总脂肪酸），维生素E含量（≥36 mg/kg）远超声称门槛，其中88.6%的样本酚类化合物（酪醇及其衍生物）含量满足健康声称要求（≥5 mg/20g）。研究强调了保护百年橄榄树遗传多样性对开发高附加值橄榄油的重要意义。

　　

引言

在地中海农业生态系统中，橄榄树占据着至关重要的地位，是自然资源、遗传和文化遗产的重要来源。其初榨橄榄油作为最早被认可的健康食品之一，其健康促进作用主要与不饱和脂肪酸（UFA）的含量以及生育酚（Tocopherols）和酚酸等微量成分有关。橄榄油中丰富的单不饱和脂肪酸（MUFA），特别是油酸（Oleic acid），不仅对消费者心血管健康有益，还贡献于产品的稳定性，并凸显其感官特性。在生育酚中，α-生育酚最为丰富，占总含量的90%，这些化合物对身体组织具有对抗自由基的保护作用，有助于预防神经退行性疾病，同时本身也是橄榄油的抗氧化剂。羟基酪醇（Hydroxytyrosol）和酪醇（Tyrosol）衍生物是初榨橄榄油中主要的酚类，与油的抗氧化活性及其赋予的辛辣和苦味风味相关。此外，这些酚类化合物由于其抗氧化和抗炎作用，能保护人体免受氧化损伤，同时降低心血管疾病和年龄相关疾病的危险因素。

橄榄油的成分，包括其生物活性化合物，受到多种因素的影响，导致不同油样间存在显著差异。这些差异通常与遗传多样性有关，并涉及当地农业气候条件的适应性和抗性、栽培实践、采收期和提取条件等多因素相互作用。例如，在开花和采收期间温度超过25°C会对提取油中油酸的比例产生不利影响。此外，每年的气候波动会给橄榄树带来胁迫，导致生育酚和酚酸含量发生显著变化。橄榄的成熟度指数也很重要，酚类浓度在成熟度指数较低时增强，而与单不饱和酸相反。根据其成分，橄榄油可以进行营养声明和/或健康声称，生产者可将其用作商业优势。欧洲食品安全局（EFSA）正式承认了与食用橄榄油相关的一些有益作用，批准了特级初榨橄榄油（EVOO）关于其不饱和脂肪酸、羟基酪醇、酪醇及其衍生物以及生育酚含量的声称使用。

材料与方法

采样

研究共分析了159份初榨橄榄油，这些油来自葡萄牙C?a Valley地区112棵百年树龄的橄榄树所产的果实。样本在连续三个采收季（2020–2022年）收集。这些树木分布在河谷不同分区的八个传统橄榄园中。该地区气候特点是显著的季节性温度波动和全年不规则的降雨。最高温度出现在6月至8月，经常超过30°C，而冬季最低温度可降至5°C以下。平均季节温度通常从冬季的约5°C到夏季的25°C。降雨主要集中在秋季和冬季，2月、11月和12月有显著峰值。相比之下，夏季月份非常干燥，降水量常接近于零。这种气候模式是地中海地区的特征，定义为炎热干燥的夏季和温和凉爽多雨的冬季。根据树龄指示标准（如树干和树冠结构、植株整体完整性以及所有者提供的信息）选择树木。每个果园每公顷约有100棵树，种植间距为10 × 10米。这些树仅依靠雨水灌溉，营养生长有限，每年进行最少量修剪。土壤为薄而贫瘠的片岩淋溶土，坡度约20%至30%，通过每年春秋两季的耕作来控制杂草生长。每年4月施用复合肥（7:14:14），其中含7% N（5%铵态氮和2%尿素氮）、14% P₂O₅（11%水溶性）和14% K₂O。尽管树龄古老，这些树木的具体品种仍未确定，缺乏任何关于其遗传分类的信息。每棵选定的树都进行了标记和地理参考以便未来识别。橄榄从每棵标识的树上手工采摘，并分别提取油脂。采收发生在10月至11月，通常在开花后150至160天，并在成熟度第二阶段（橄榄上少于一半面积出现红点）和第三阶段（超过一半面积出现红点或紫点）进行，遵循国际橄榄理事会（IOC）指南。从每棵树收集约四至五公斤橄榄以生产单独的橄榄油批次。然而，并非所有树在三个季节都能产出足够的橄榄来生产橄榄油，导致某些树在特定采收年被排除在研究之外。因此，在三年期间仅从112棵树收集到159份橄榄油。因此，只有部分油来自同一棵树在不同产季的果实。果实采收后，油脂在24小时内使用Abencor中试设备提取，遵循IPB实验室目前使用的标准方法。随后，将油过滤并包装在琥珀色玻璃瓶中，以尽量减少光诱导氧化，并在4°C下冷藏储存。所有分析均在提取后1至3个月内进行，以确保样品完整性。

脂肪酸谱

按照欧盟委员会实施条例（EU）2022/2105为EVOO提供的指南，建立每个橄榄油样品的脂肪酸谱。使用甲醇氢氧化钾和庚烷进行冷酯交换法。使用配备FID检测器（250°C）和自动进样器的Chrompack CP 9001色谱仪。进样（1μL，分流比1:50）在230°C下进行，分离使用熔融石英毛细管柱实现。氦气作为载气，保持内部压力160 kPa。为了匹配峰保留时间并校准FID，从Sigma获得了认证脂肪酸甲酯的标准混合物。

生育酚含量

使用配备荧光检测器（FLD）的Jasco系统进行高效液相色谱（HPLC）分析，根据ISO 9936:2016评估α-、β-和γ-生育酚水平，并有所修改。基于分析标准品和内标Tocol的单独校准曲线，以毫克/千克（mg/kg）橄榄油为单位对每个单独的生育酚（α-、β-和γ-生育酚）进行定量。分离在23°C下使用Supelcosil TM LC-SI硅胶柱实现，使用正己烷中2.5%（v/v）的1,4-二恶烷以0.75 mL/min的流速洗脱。数据分析通过JASCO色谱数据站的ChromNAV控制中心程序进行。

酸水解后的羟基酪醇和酪醇衍生物含量

按照Marx等人的方法，使用丁香酸作为内标，在酸水解（甲醇/水80:20, v/v中含有2 mol/L盐酸溶液）后定量酪醇和羟基酪醇含量。水解在25°C下进行6小时，期间定期涡旋混合，随后使用乙腈/水溶液（50:50 v/v）提取可溶性化合物。过滤后的溶液注入配备柱温箱和DAD的Jasco HPLC-DAD系统。化合物分离在35°C下使用C18反相柱实现，流动相为水和乙腈（均含0.1%甲酸），流速0.8 mL/min，运行20分钟。羟基酪醇和酪醇的校准曲线在甲醇/水（80:20, v/v）中制备，浓度范围为0.00031至0.0160 mg/mL。结果以羟基酪醇或酪醇的单独含量（mg/kg橄榄油）之和表示。由于仅定量了酪醇和羟基酪醇的水解形式，这导致其原始化合物的分子量和结构信息丢失，因此使用文献报道的校正因子估算其天然形式：羟基酪醇为2.2，酪醇为2.5。

结果与讨论

化学组成

本研究评估了在三个连续采收年（2020–2022年）从百年树龄橄榄树果实中提取的159份独立橄榄油的甘油酯脂肪酸谱、游离生育酚以及酸水解后的羟基酪醇和酪醇含量。在所评估的单个脂肪酸中，并非所有来自不同选定植株的样品都达到欧盟法规为EVOO设定的水平。来自C?a Valley地区的所研究橄榄油的脂肪酸谱总结显示，油酸（C_18:1）在所有样品中占主导地位，平均为71.4%，范围从57.5%到79.5%，落在EVOO类别的参考值范围内。而棕榈酸（C_16:0）丰度位居第二，平均为13.0%，范围从9.4%到17.7%，也在参考值范围内。亚油酸（C_18:2）丰度排名第三，平均为10.1%，值范围从2.2%到18.8%。然而，有两个样品（树141和57）低于EVOO类别的阈值（2.5%）。棕榈油酸（C_16:1）范围从0.09%到2.1%，只有一个样品（树54）显示值低于0.3%，即EVOO分类允许的最小参考值。亚麻酸（C_18:3）在所有研究的159种油中均低于最大参考值1.4%，其丰度在0.6%至1.4%之间变化。

总体而言，单不饱和脂肪酸（MUFA）范围从59.7%到81.2%，而总多不饱和脂肪酸（PUFA）在2.9%到19.8%之间变化，饱和脂肪酸（SFA）从12.9%到21.5%。这些结果与先前的研究一致，显示MUFA范围在60%到80%之间。Gomez-del-Campo等人也报告了PUFA值在3.5%到14.5%之间，亚油酸值在3%到14%之间。根据Baccouri等人的说法，脂肪酸的相对丰度因橄榄品种而异。本研究发现的油酸含量平均值（约72%）与Peres等人和Rodrigues等人关于葡萄牙橄榄品种生产的橄榄油的结果一致。这与Cecchi等人从62种声明地理来源的商业化葡萄牙橄榄油收集的数据相似。观察到的较高油酸水平与对百年橄榄树的研究结果一致，这些研究报告油酸丰度高达总脂肪酸的78%。Passeri等人在研究百年马耳他橄榄树的油时，观察到脂肪酸组成的偏差，与先前的研究相比存在差异。与先前发现不同，马耳他样品的主要脂肪酸出现显著不平衡，许多样品中油酸水平低于55%，部分样品棕榈酸丰度超过20%。此外，亚油酸和棕榈油酸水平也观察到偏差。特别值得注意的是亚麻酸（C_18:3）的高百分比，超过了3%，峰值达到7%，而本研究中记录为1.4%。此外，报告了棕榈油酸（C_16:1）的高浓度，高达5.05%，超过了允许的3.5%，而本研究发现油的棕榈油酸水平低于0.3%的阈值。

关于维生素E含量，鉴定并定量了α-生育酚、β-生育酚和γ-生育酚。每个生育酚以及总维生素E水平的详细结果如表1所示。α-生育酚最为丰富，平均为266 mg/kg，从121到474 mg/kg不等，平均占总维生素E质量的97.7%。其次是γ-生育酚，平均为4.6 mg/kg，范围从0.30到15.9 mg/kg，而β-生育酚平均为1.7 mg/kg（范围从0.11到3.38 mg/kg）。总体维生素E水平显著较高，样品平均为272 mg/kg，范围从123 mg/kg到484 mg/kg。这些水平略高于Cecchi等人提出的水平（1000个样品范围从100到300 mg/kg），以及Faci等人支持橄榄油维生素E参考值在93–210 mg/kg范围内的水平。我们的结果与Serrano等人针对Picual和Arbequina品种的结果相似，平均维生素E值为248 mg/kg，范围从155 mg/kg到383 mg/kg，更接近本研究中观察到的数值。先前关于葡萄牙品种的结果显示数值与本研究一致，数值落在本研究范围内，有时根据品种更高，从Verdeal品种的124 mg/kg到Lentisca品种的630 mg/kg不等。Baccouri等人同样注意到α-生育酚占主导地位，尽管水平低于本研究，根据品种不同从87到302 mg/kg不等。他们还观察到β-生育酚是一种丰度较低的化合物，浓度低于5 mg/kg，与本研究的发现一致。然而，γ-生育酚的数量范围从2.6到9.0 mg/kg，在不同品种间没有显示出显著变化，而在本研究中，它达到了高达15.9 mg/kg的值。Faci等人也报告了阿尔及利亚品种的γ-生育酚值高于β-生育酚，根据树木海拔高度最高可达20 mg/kg。

表1显示了所研究油中总羟基酪醇和酪醇衍生物的含量，是在酸水解后估算的。平均而言，羟基酪醇衍生物为294 mg/kg，范围从40到982 mg/kg，而酪醇衍生物平均为174 mg/kg，变化范围从21到1277 mg/kg。Passeri等人在研究从百年马耳他橄榄树获得的油时也观察到了这种变异性，其中羟基酪醇和酪醇在不同基因型间表现出最大的多样性，范围分别为125到1807 mg/kg和15到374 mg/kg。Rodrigues等人在分析葡萄牙品种Galega Vulgar时观察到较小的变化，羟基酪醇和酪醇范围分别为87到325 mg/kg和37到121 mg/kg。Zago等人识别的数值显著较低，平均羟基酪醇为14 mg/kg，酪醇为5.4 mg/kg，而Gomez-del-Campo等人报告了更高的数值，羟基酪醇最高为18.3 mg/kg，酪醇最高为24.8 mg/kg。在Cecchi等人最近的研究中，报告了1000种商业EVOO中总亲水性酚类化合物含量的广泛范围。这些数值从低于50 mg/kg到超过1000 mg/kg不等。然而，大多数分析的油含量落在150–650 mg/kg的范围内。

营养与健康声称

不饱和脂肪含量

根据欧盟委员会授权条例（EU）N°. 116/2010，不饱和脂肪（MUFA加PUFA）丰度超过总脂肪酸70%的橄榄油可以标注为“高不饱和脂肪”。此类油还可以带有健康声称，声明“在饮食中用不饱和脂肪替代饱和脂肪有助于维持正常的血液胆固醇水平”。此外，如果仅MUFA的丰度超过总脂肪酸的45%，则营养声称“高单不饱和脂肪酸”也可能适用。显示了一个直方图，说明了来自百年树的橄榄油在总不饱和水平（MUFA加PUFA）特定范围内的分布，表明所有样品都超过了满足营养/健康声称所需的最低水平。此外，还绘制了总不饱和脂肪酸的理论正态分布曲线，该曲线源自所研究油的MUFA加PUFA含量的平均值和标准偏差。直方图揭示了实验总不饱和脂肪的近似正态分布，左侧尾部略有偏斜，表明最高值向左偏移：众数 > 中位数 > 平均值。如表1所示，所有检查的橄榄油都表现出单不饱和脂肪酸（MUFA）水平超过59%，超过了“高单不饱和脂肪酸”营养声称所需的最低阈值（45%）。此外，所有油都证明不饱和脂肪酸比例超过70%（最低水平超过78%），因此有资格获得额外的“高不饱和脂肪”营养声称。而且，它们符合健康声称，即“在饮食中用不饱和脂肪替代饱和脂肪有助于维持正常的血液胆固醇水平”。值得注意的是，虽然橄榄油通常含有85%的不饱和脂肪，贡献产品能量的85%，但在分析的159种橄榄油中，有17种油的平均不饱和脂肪含量超过85%。这些油来自16棵百年树。此外，值得注意的是，所研究的159种油中有68.5%显示出相对丰度在83%到85%的不饱和脂肪之间。

本研究中观察到的不饱和脂肪酸量（78–88%）与EVOO的数值和文献报道一致，例如Marino等人和El Chami等人报告的范围在80–85%之间。相比之下，Adakalic和Lazovic报告了来自黑山百年橄榄树的油的数值较低，范围在70%到75%之间。同样，Hijawi和Passeri等人也指出，来自百年树的油的不饱和脂肪酸百分比低于70%。值得注意的是，52.8%的评估油（159种油中的84种）表现出油酸（C_18:1）的相对丰度等于或超过70%，从而仅凭自身就满足了“高不饱和脂肪”营养声称的最低要求。最后，存在一个额外的健康声称，与亚麻酸（C_18:3）含量及其“维持正常血液胆固醇水平”的能力有关，如果每100克产品和100千卡含有至少0.3克亚麻酸，则可用于橄榄油，需要告知消费者每天应摄入2克这种酸才能获得这种有益效果。

维生素E含量

维生素E浓度超过36 mg/kg的橄榄油有资格获得“高维生素E含量”的营养声称和健康声称，声明“维生素E有助于保护血液脂质免受不良氧化”。所研究油的平均维生素E浓度，与代表每棵树的维生素E浓度的相应理论正态分布曲线一起描绘。表和都明确显示，所有油都有资格获得这两种声称，因为它们的维生素E含量超过100 mg/kg，几乎是要求最低浓度的三倍。此外，值得注意的是，大约56%的评估油表现出维生素E浓度在250至350 mg/kg之间。值得注意的是，来自编号为32和127的树的两份油表现出维生素E含量落在400–500 mg/kg范围内，是声称要求最低水平的12-13倍。还表明，所研究油中维生素E的浓度符合正态分布（众数 ≈ 中位数 ≈ 平均值）。本研究的结果与文献中记录的相符。先前的研究报告称，来自巴西和摩洛哥的样品的橄榄油中维生素E含量从100到200 mg/kg不等。相反，Squeo等人发现，来自意大利普利亚百年树的橄榄油表现出维生素E浓度在200–300 mg/kg范围内。Pérez等人报告了从Istarska Bjelica和Dokkar品种的橄榄中提取的油中生育酚浓度的显著变化（范围从89到1410 mg/kg）。最近Cecchi等人分析了来自不同地理区域（澳大利亚、希腊、意大利、葡萄牙、西班牙和突尼斯）两个产季（2013和2014年）的1000种橄榄油，发现生育酚浓度范围从小于100 mg/kg到大于500 mg/kg。然而，大多数油（约97–98%）表现出浓度在100到400 mg/kg之间，与本研究的结果一致。

羟基酪醇和酪醇含量

根据欧盟委员会授权条例（EU）N°. 432/2012，含有每20克油至少5毫克羟基酪醇及其衍生物的橄榄油有资格获得健康声称，声明“橄榄油中的多酚有助于保护血液脂质免受不良氧化”。但是，必须澄清这种有益效果仅适用于每日摄入20克橄榄油。说明了基于羟基酪醇和酪醇在mg/20g橄榄油中平均浓度的油分布，提供了可能符合相关健康声称的样品数量的视觉描述。此外，该图描绘了理论正态分布曲线，证明实验数据符合正偏态分布，其特征是分布右侧有一个尾部（众数 < 中位数 < 平均值）。然而，并非所有样品都符合此类声称的标准。在分析的159份橄榄油样品中，只有90%含有超过5 mg/20g的油，满足了多酚相关健康声称的要求。值得注意的是，所检查的油中有四份的羟基酪醇及其衍生物水平超过了阈值5-7倍，突出了食用这些特定油所带来的高健康益处潜力。

这些发现与Shavakhi等人在伊朗橄榄油中报告的范围（4–31 mg/20g）非常接近，并且超过了Tsimidou等人记录的值（范围从0到12 mg/20g）。这些结果证实了百年树作为有资格获得多酚相关健康声称的橄榄油潜在来源的可行性。在百年橄榄园中观察到的遗传多样性，加上各种内在和外在因素，赋予了这些油独特性和区别性。

结论

在本工作中，证实了从百年橄榄树获得的橄榄油在满足不饱和脂肪酸、生育酚、羟基酪醇及其衍生物方面的营养和健康声称法规的潜力。对于高不饱和脂肪酸含量的声称，所有样品都符合这些脂肪酸超过70%的橄榄油法规。至于维生素E，所有样品都允许该声称，因为它们的浓度超过了要求的36 mg/kg。值得注意的是，44.29%的样品记录的维生素E水平在200–300 mg/kg油之间，而36.43%的样品显示值在300–400 mg/kg范围内，最大值达到483.88 mg/kg。关于酚酸，89%的样品满足了与多酚相关的健康声称要求，适用于超过5 mg/20g的橄榄油。约75%处于5–10 mg/20g范围内，一些样品浓度高于15%，最大值达到31.8 mg/20g。本研究中分析的油中发现的成分揭示了营养和健康声称的显著潜力，并突出了保护这些百年标本的重要性。