内源性p21通过调控新生DNA合成速率维持基因组稳定性

本刊推荐：为解决DNA复制速率异常导致基因组不稳定的问题，研究人员围绕p21在DNA损伤耐受（DDT）通路中的核心作用展开研究。结果揭示，内源性p21水平通过其PCNA结合域，精细调控DNA聚合酶ι（Pol ι）/p53、PrimPol和Pol κ在不同p21表达水平下参与新生DNA合成的选择，从而防止染色体不稳定性（CIN）。该发现阐明了p21在维持基因组稳定性中的新机制，对理解肿瘤发生具有重要意义。

　　

在生命的神秘世界里，细胞分裂如同一次精密的宇宙航行，而DNA复制则是这次航行的核心任务。任何细微的差错都可能导致灾难性的后果——基因组不稳定，这正是癌症等疾病的根源。DNA复制的速度至关重要，既不能太慢，导致复制压力（replication stress）和DNA损伤堆积；也不能太快，以免产生不稳定的复制结构。然而，调控这一“生命速率”的内在机制，长期以来是科学家们探索的焦点。

细胞拥有一套复杂的DNA损伤耐受（DNA Damage Tolerance, DDT）系统来应对复制过程中的障碍。其中，一类被称为特殊DNA聚合酶（Specialized DNA Polymerases, S-Pols）的酶，如Pol η、Pol κ、Pol ι等，以及一种兼具引物酶和聚合酶活性的PrimPol，在DNA损伤位点协助复制。但它们在正常复制中的角色，以及如何被精确调控以防止基因组不稳定，仍有许多未解之谜。另一个关键角色是p21，它通常以细胞周期蛋白依赖性激酶（Cyclin-dependent kinase, CDK）抑制剂的形象出现。然而，在正常循环细胞中，p21的表达水平较低，不足以抑制CDK，其生理功能一度被认为是“残留的”或无关紧要的。有趣的是，此前的研究报告了看似矛盾的结果：有的显示p21下调导致新生DNA链变短，有的则显示其变长。这一悖论凸显了我们对p21在DNA复制中精确功能的认知存在巨大空白。

为了解决这一难题，研究人员在《科学·进展》（SCIENCE ADVANCES）上发表了题为“内源性p21水平通过抑制过度和受限的新生DNA合成来保护基因组稳定性”的研究论文。该研究揭示了内源性p21水平作为一个关键的分子“调速器”，通过其与增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA）的相互作用，精细调控不同DNA聚合酶（包括Pol ι/p53复合物、PrimPol和Pol κ）参与新生DNA合成的选择，从而维持了DNA复制的适当速率和基因组的稳定性。

为开展此项研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术：利用小干扰RNA（siRNA）和CRISPR-Cas9基因敲除技术在不同细胞系（如U2OS, HCT116, RPE-1, HT1080, H1299, SKOV3）中进行基因敲低（KD）或敲除（KO）；通过DNA纤维伸展技术（DNA fiber spreading）结合核苷类似物（CldU/IdU）标记来定量分析新生DNA链的长度；采用免疫荧光显微术检测蛋白质核焦点形成（如V5-PrimPol, GFP-Pol κ foci）以及复制压力标志物（如γH2AX, 53BP1 nuclear bodies）；利用微核实验和异常后期（anaphase aberration）分析来评估染色体不稳定性（CIN）；并通过Western blotting和定量实时PCR进行蛋白和mRNA水平验证。

p21下调上调和下调新生DNA合成

研究人员首先重复了之前相互矛盾的研究结果，发现使用不同的p21 siRNA（sip21#1和sip21#2）确实会导致相反的表型：高效的sip21#1敲低导致新生DNA链变短，而低效的sip21#2敲低则导致DNA链变长。关键在于敲低效率：部分敲低p21（残留可检测水平）导致DNA链延长，而完全敲低或敲除p21（无法检测到p21）则导致DNA链缩短。这种双模态效应并非siRNA的脱靶效应，因为在多种细胞系的p21基因敲除克隆中也观察到DNA链缩短的现象。进一步的拯救实验表明，p21的PCNA结合域（PIP motif），而非其CDK结合域，是调控DNA复制速率的关键。表达能结合PCNA的p21突变体（p21^CDK?）可以挽救表型，而PCNA结合缺陷的突变体（p21^PIPMut）则不能。这表明p21-PCNA相互作用是调控核心。

p21水平决定DNA聚合酶的选择

那么，p21水平如何影响DNA链长度？研究人员推测不同DNA聚合酶的参与可能是原因。结果显示，在部分p21敲低（sip21#1-low）导致DNA链延长的模型中，敲低PrimPol可以逆转这一表型，而敲低Pol κ则无影响。相反，在完全p21敲低（sip21#1-high）或p21敲除导致DNA链缩短的模型中，敲低Pol κ可以挽救表型，而敲低PrimPol无效。这表明，生理水平的p21抑制了PrimPol和Pol κ参与新生DNA合成。当p21部分降低时，PrimPol被“释放”出来主导复制，导致长链；当p21完全缺失时，Pol κ被“释放”出来主导复制，导致短链。免疫荧光实验进一步证实，部分p21敲低增加了PrimPol核焦点的形成，而完全敲低则增加了Pol κ核焦点的形成，且这些效应都依赖于p21的PCNA结合能力。

完全而非部分p21耗竭给S期进程带来压力

长DNA链是否一定意味着复制压力？研究人员将p21部分敲低与PARP抑制剂奥拉帕利（olaparib）处理进行比较。两者都引起PrimPol依赖的DNA链延长和对S1核酸酶敏感（提示存在单链DNA间隙）。然而，奥拉帕利处理增加了S期细胞比例和γH2AX（DNA双链断裂标志物）水平，表明存在复制压力；而p21部分敲低虽增加了S期细胞的BrdU掺入量，但并未增加S期细胞比例或γH2AX水平。相反，p21完全敲低则显著增加了γH2AX水平。这表明，并非所有长DNA链都伴随复制压力，而p21完全敲低导致的短DNA链则与典型的复制压力相关。

部分和完全p21耗竭引发PrimPol和Pol κ介导的染色体不稳定性，但在复制压力相关标志物水平上存在差异

接下来，研究人员评估了这些复制动态改变的功能后果。无论是部分还是完全p21敲低，都会导致微核和异常后期（如染色体桥、滞后染色体）等染色体不稳定性（CIN）显著增加。关键在于，部分p21敲低引发的CIN依赖于PrimPol，而完全敲低引发的CIN依赖于Pol κ。更重要的是，部分p21敲低引发的CIN不伴随γH2AX的积累、PICH阳性超细桥（ultrafine bridges）或G1期53BP1核体（nuclear bodies）的增加，即不依赖于典型的复制压力标志。而完全p21敲低引发的CIN则伴随着这些标志物的显著增加。这表明p21下调可通过两种不同的机制诱发CIN：一种与复制压力无关（PrimPol依赖），另一种与复制压力相关（Pol κ依赖）。

p21和Pol ι/p53阻止PrimPol介导的DNA复制

p21如何抑制PrimPol？之前的研究表明Pol ι/p53复合物可以抑制PrimPol。本研究进一步阐明了三者之间的关系。在p53敲除（p53 KO）细胞中（仍表达p21），新生DNA链延长，且依赖于PrimPol。在p21敲除（p21 KO）细胞中重新表达p21，可以恢复正常链长；但在p53 KO细胞中重新表达p21，却无法挽救链延长表型。这表明，抑制PrimPol需要p21和p53同时存在。此外，Pol ι基因敲除也会导致PrimPol依赖的DNA链延长，且与部分p21敲低具有 epistasis（上位性）关系，即两者同时敲低不会产生叠加效应。因此，p21通过支持Pol ι/p53复合物的功能来间接抑制PrimPol。在p53缺失的癌细胞（如H1299, SKOV3）中，残留的p21水平决定了主导复制的聚合酶：p21可检测的H1299细胞依赖PrimPol，而p21几乎检测不到的SKOV3细胞则依赖Pol κ，相应的CIN也分别由PrimPol和Pol κ驱动。

Pol κ和η在p21敲除后阻止PrimPol介导的DNA复制

一个有趣的问题是，为何在p21完全敲低且同时敲低Pol κ的情况下，PrimPol仍不能参与复制？研究发现，需要同时敲低Pol κ和另一个S-Pol——Pol η，才能在p21敲除背景下恢复PrimPol的核焦点形成和DNA链延长。这表明，当p21完全缺失时，Pol κ和Pol η共同作用，阻止了PrimPol介入复制。而在p21部分敲低时，Pol ι是抑制PrimPol的主要因素。因此，PrimPol的活性受到严格的多层次调控。

综上所述，这项研究揭示了内源性p21水平是控制DNA复制速率和基因组稳定性的核心枢纽。其通过PCNA结合域，根据自身表达水平的高低，分层级地调控不同DNA聚合酶（Pol ι/p53, PrimPol, Pol κ/η）的活性。生理水平的p21支持Pol ι/p53介导的复制，抑制PrimPol和Pol κ，确保适度的复制速率和基因组稳定性。p21部分降低会解除对PrimPol的抑制，导致复制加速和复制压力无关的CIN；而p21完全缺失则会解除对Pol κ的抑制，导致复制减速和复制压力相关的CIN。该研究不仅解决了关于p21在DNA复制中作用的长期悖论，更重要的是，它确立了低水平p21通过PCNA相互作用在维持基因组稳定性中的关键生理功能，为理解p53缺失背景下肿瘤基因组的演化提供了新的机制框架。